Protitumorsko delovanje genskega elektroprenosa kombinacije plazmidov z zapisom za interlevkina IL-2 in IL-12 na različnih mišjih tumorskih modelihKomel, Tilen (Avtor) Čemažar, Maja (Mentor) Bošnjak, Maša (Komentor) B16F10CT26genski elektroprenosIL-2IL-12Znanstveno izhodišče: V zadnjih letih so se z razvojem novih tarčnih terapij posledično spremenili tudi načini terapije raka. V ospredje prihajajo različni pristopi na področju imunoterapije, kot so zaviralci imunskih kontrolnih točk, celična terapija, protitumorske vakcine in genska terapija z uporabo različnih citotoksičnih in imunomodulatornih molekul. Kot dostavni sistem pri genski terapiji raka lahko uporabimo tudi genski elektroprenos, kjer z dovajanjem električnih pulzov omogočamo lokalni vnos plazmidne DNA v celice različnih tkiv. Tako lahko dosežemo sočasni vnos dveh plazmidov z zapisom za interlevkina 2 (IL-2) in 12 (IL-12) v tumorje, ki se nato izražata v transfeciranih celicah in kot vnetna interlevkina sprožita imunski odziv. Protitumorska učinkovitost genskega elektroprenosa posameznega plazmida IL-2 ali plazmida IL-12 je bila dokazana že v številnih predkliničnih in tudi kliničnih študijah. Pri bolnikih, ki slabše odgovorijo na terapijo, bi lahko genski elektroprenos interlevkinov v kombinaciji z drugimi citokini ali z drugimi imunoterapevtskimi pristopi (npr. zaviralci imunskih kontrolnih točk) bistveno prispeval k celokupni učinkovitosti terapije. Kombinacija IL-2 in IL-12 temelji na njunem sinergističnem mehanizmu delovanja. Tako bi lahko imunski sistem bolje aktivirali ter s tem povečali protitumorsko učinkovitost v primerjavi s samostojnim elektroprenosom plazmida IL-2 ali IL-12. Namen doktorske naloge je bil določiti protitumorsko in antiangiogeno delovanje intratumorskega genskega elektroprenosa plazmidov z zapisom za IL-2 in IL-12 na dveh različnih mišjih tumorskih modelih. Raziskali smo učinek genskega elektroprenosa plazmidov na tumorske celice in vitro, protitumorsko in antiangiogeno delovanje kombinacije v primerjavi s samostojno terapijo, vpliv na izražanje različnih citokinov po terapiji ter prisotnost različnih imunskih celičnih populacij in vivo. Z navedenimi raziskavami smo želeli preveriti učinkovitost te terapije in poglobiti razumevanje o mehanizmih delovanja kombinacije IL-2 in IL-12 v tumorju. Metode: Najprej smo določili vpliv genskega elektroprenosa plazmidne DNA na preživetje in izražanje genov v dveh mišjih tumorskih celičnih linijah, melanoma B16F10 in raka debelega črevesja CT26, in vitro. Testirali smo dva različna pulzna protokola. Učinkovitost transfekcije 48 ur po genskem elektroprenosu pEGFP in pDsRed smo določili z uporabo fluorescentne mikroskopije v realnem času (večfunkcijski čitalec Cytation 1). Za učinkovitost transfekcije 48 ur po genskem elektroprenosu plazmidov IL-2 in IL-12 pa smo celicam izolirali RNA in določili raven izražanja interlevkinov IL-2 in IL-12 z metodo kvantitativnega PCR v realnem času (qRT-PCR) in testom ELISA. Poleg učinkovitosti transfekcije smo po genskem elektroprenosu določili še preživetje celic s pomočjo reagenta PrestoBlue?. V naslednjem sklopu smo določili učinkovitost transfekcije genskega elektroprenosa plazmidne DNA z zapisom za EGFP in DsRed in vivo. Tumorje smo analizirali s pomočjo pretočnega citometra BD FacsCantoTM in fluorescentne mikroskopije (mikroskop Olympus BX-51). V nadaljevanju smo nato določili protitumorski učinek kombinirane terapije na mišjih tumorskih modelih B16F10 in CT26. Rast tumorjev smo spremljali z merjenjem treh pravokotnih premerov tumorjev s kljunastim merilom. Pri miših, pri katerih smo opazili popolni odgovor (100 dni po terapiji brez otipljivega tumorja), smo tumor ponovno nasadili na levi bok in rast spremljali še dodatnih 100 dni. Odziv na terapijo oz. mehanizme protitumorskega učinka po genskem elektroprenosu smo dodatno ovrednotili z določevanjem infiltracije imunskih celic v tumor z imunohistokemičnim barvanjem in določevanjem izražanja izbranih citokinov s testoma ELISA in Magpix v tumorskih lizatih. Tumorske rezine smo imunohistokemično pobarvali s primarnimi oz. sekundarnimi protitelesi proti površinskim markerjem celic T pomagalk (CD4+), celic T ubijalk (CD8+), makrofagov (F4/80+ in MHC II+), dendritskih celic (CD11+) in endotelijskih celic (CD31+). Slike rezin smo zajeli s pomočjo svetlobne mikroskopije (mikroskop Olympus BX-51) pod 400-kratno povečavo. Optimizacijo terapije smo izvedli tako, da smo tumorjem 24 ur pred terapijo injicirali 50 µl kolagenaze (s koncentracijo 250 IU/ml) ter hialuronidazo (s koncentracijo 10.000 IU/ml) 2 uri pred terapijo. V zadnjem sklopu smo na CT26 tumorskem modelu določili še izventarčno in sistemsko učinkovitost kombinirane terapije (abskopalni učinek) ter ocenili aktivnost splenocitov po kombinirani terapiji. Raziskave na živalih so potekale v skladu z navodili in dovoljenjem Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano Republike Slovenije (št. dovoljenja U34401-1/2015/17 in U34401-3/2022/11). Za obdelavo podatkov smo uporabili program GraphPad, s pomočjo katerega smo ugotavljali razlike med skupinami z uporabo različnih statističnih testov. Rezultati: Za naše poskuse smo izbrali dve mišji celični liniji; melanoma B16F10 in raka debelega črevesja CT26. V in vitro poskusu smo tri dni po genskem elektroprenosu plazmidov z EGFP, DsRed ter njune kombinacije in IL-2, IL-12 in njune kombinacije določili učinkovitost transfekcije in preživetje po elektroprenosu. Učinkovitost transfekcije je bila višja po elektroporaciji z EP1 protokolom in višja pri celicah B16F10 kot pri CT26. To smo dokazali tako pri rezultatih izražanja fluorescentnih proteinov kot tudi obeh interlevkinov. Genski elektroprenos plazmidov EGFP in DsRed ter njune kombinacije smo izvedli tudi v oba tumorska modela in vivo. Podatki pretočne citometrije in mikroskopije so pokazali, da je bila v tumorskem modelu B16F10 povprečna učinkovitost transfekcije po elektroporaciji z EP1 protokolom pri vseh skupinah večja kot po EP2, vendar razlike niso statistično pomembne. Nasprotno pa v CT26 nismo zaznali transfeciranih celic pri nobeni izmed dveh metod. Proučevali smo tudi protitumorski učinek genskega elektroprenosa kombinacije plazmidov IL-2 in IL-12 na obeh mišjih tumorskih modelih. Pri B16F10 modelu smo v skupini, ki je bila tretirana s kombinacijo plazmidov, opazili največji zaostanek v rasti tumorja v primerjavi z ostalimi skupinami. V tej skupini smo opazili tudi popolne odgovore in preživetje po ponovnem injiciranju tumorskih celic. Enak poskus smo ponovili pri tumorskem modelu CT26, kjer smo v skupini, tretirani s kombinacijo plazmidov, opazili zaostanek v rasti tumorjev, vendar pa nismo dosegli popolnih odgovorov, zato smo na tem tumorskem modelu izvedli optimizacijo terapije, tako da smo učinkovitost transfekcije izboljšali s predhodno obdelavo tumorjev s kolagenazo in hialuronidazo. Po optimizaciji smo opazili večji zaostanek v rasti v vseh skupinah, tretiranih s plazmidoma IL-2 in IL-12 posamezno ter njuno kombinacijo, v skupini s kombinacijo pa tudi popolne odgovore in preživetje po ponovnem injiciranju tumorskih celic. Pri CT26 tumorskem modelu smo določili še izventarčno in sistemsko učinkovitost optimizirane kombinirane terapije. Največji abskopalni efekt in citotoksično aktivnost splenocitov smo opazili pri tumorjih, tretiranih s kombinacijo. Določili smo tudi mehanizme protitumorskega učinka po genskem elektroprenosu in vivo na tumorskem modelu B16F10 in CT26. Za oceno učinkovitosti terapije smo opravili histološko analizo ter določili koncentracijo 32 vnetnih citokinov v vzorcih tumorja in seruma. Pri obeh modelih je bila infiltracija različnih imunskih celic najvišja pri skupini, tretirani s kombinacijo plazmidov. Opazili smo tudi povišanje različnih vnetnih citokinov v vseh skupinah, tretiranih z elektroporacijo, v skupini s kombinacijo plazmidov pa je bila močno povišana koncentracija IL-12, IFN? in TNF?, za katere je značilna izrazita protitumorska učinkovitost. Zaključki: Naši podatki kažejo na uspešnost genskega elektroprenosa kombinacije plazmidov z zapisom za IL-2 in IL-12 na dveh tumorskih modelih z različnim imunskim statusom. Kombinacija IL-2 in IL-12, ki se izražata v tumorskem okolju v zadostni količini, povzroči migracijo in stimulacijo imunskih celic na mesto tumorja, ki skupaj z antiangiogenim delovanjem IL-12 povzročijo uničenje tumorskih celic. Poleg tega je naš kombinirani pristop privedel tudi do protitumorskega imunskega spomina. V raziskavi smo tako dokazali, da je genska terapija s kombinacijo plazmidov IL-2 in IL-12 učinkovita za lokalno in tudi sistemsko terapijo tumorjev. Kljub dobrim rezultatom na obeh tumorskih modelih pa bi lahko terapijo na modelu CT26 še dalje optimizirali, da bi dosegli primerljivo učinkovitost z modelom B16F10. Rezultati doktorske naloge so doprinesli k razumevanju delovanja IL-2 in IL-12 na ravneh in vitro ter in vivo. Nenazadnje bodo rezultati doktorske naloge prav tako v pomoč pri potencialnem vpeljevanju terapije s kombinacijo teh dveh interlevkinov v klinično prakso.20232023-10-14 07:15:07Doktorsko delo/naloga151641VisID: 25294sl