Analiza vpliva proteina HcPro virusa Y krompirja na transkripcijski faktor PTI5 v tobaku Nicotiana benthamiana in proizvodnja dvoverižne RNA za uporabo kot pesticid proti koloradskemu hroščuFerenc, Rok (Avtor) Gruden, Kristina (Mentor) krompirutišanje RNApesticid na osnovi dsRNAobramba rastlin proti PVYKrompir je glede na svetovno porabo ena izmed pomembnejših poljščin, vendar njegov pridelek desetkata koloradski hrošč, ki postaja zmeraj bolj odporen proti obstoječim pesticidom, in okužba z virusom PVY, ki v naravi zelo hitro mutira. Namen naših poskusov je bil preizkusiti okolju prijaznejšo alternativo obstoječim pesticidom proti koloradskemu hrošču in raziskati mehanizem obrambe rastlin proti PVY. Dvoverižna RNA je zelo obetaven kandidat za pesticid proti koloradskemu hrošču zaradi svoje selektivnosti, hkrati pa se v naravi hitro razgradi na neškodljive produkte. Preizkusili smo pesticidno aktivnost dsRNA, ki cilja gen Mesh. Gen Mesh ima vlogo pri tvorbi septatnih stikov v črevesju koloradskega hrošča. Njegovo utišanje deluje pesticidno tudi proti koruznemu hrošču. dsRNA iz gena Mesh (dsMesh) smo pridobili in vivo, in sicer smo gen Mesh vstavili v plazmid L4440 za izražanje dsRNA, z njim transformirali E. coli z onesposobljeno funkcijo razgradnje dsRNA ter pripravili bakterijski ekstrakt, s katerim smo hranili ličinke koloradskega hrošča. Izkazalo se je, da je dsMesh, pridobljen in vivo, uspešen pri zatiranju ličink koloradskega hrošča in ima primerljivo učinkovitost kot pesticid spinosad ter in vitro pridobljen dsMesh. Za raziskavo mehanizmov rastlinske obrambe rastlin proti virusu PVY smo opazovali vpliv virusnega proteina HcPro, znanega zaviralca utišanja RNA, na rastlinski transkripcijski faktor obrambnih genov PTI5. S PCR smo pripravili konstrukt HcPro z vezanim reporterjem TFP. Z uporabo sistema Gateway smo pripravili ekspresijski vektor, s katerim smo transformirali agrobakterije, s temi pa nato v kombinaciji s PTI5-YFP prehodno transformirali tobak. Iz opazovanj transformiranih listov rastlin pod konfokalno lupo smo prišli do zaključka, da HcPro ne sproži obrambne reakcije rastlin prek PTI5, saj ne sproži njegovega izražanja in ne povzroči njegove stabilizacije ali spremembe njegove lokalizacije. Iz fenotipizacije transformiranih rastlin smo zaključili, da HcPro v krompirju sorte Rywal ne sproži preobčutljivostnega odziva in ne razvije nekrotičnih lezij kot posledica obrambe s posredovanjem obrambnega gena Nytbr.20232023-10-13 15:20:01Magistrsko delo/naloga151638VisID: 22617COBISS_ID: 174326787sl