Testiranje in optimizacija večtarčnega pristopa za ovrednotenje integritete nukleinskih kislinDeurič, Jana (Avtor) Dobnik, David (Mentor) dPCRnukleinske kislineintegritetatestiranjeTehnologija digitalne verižne reakcije s polimerazo (dPCR) je novejša metoda s številnimi prednostmi glede na ostale PCR tehnike, kot o večja občutljivost, natančnost in specifičnost (Quan in sod., 2018). dPCR omogoča tudi večtarčni pristop s katerim lahko hkrati ciljamo in kvantificiramo različne dele v istem genomu (Furuta-Hanawa in sod., 2019). Namen magistrske naloge je bil pripraviti, testirati in optimizirati večtarčni pristop s katerim bi lahko ovrednotili integriteto izbrane nukleinske kisline. Kot raziskovalni objekt nukleinskih kislin smo uporabili umetno sintetiziran konstrukt dvoverižne DNA (gBlock). Predmet raziskovanja sta bila dva umetna konstrukta v katera smo združili sekvence 4 oz. 5 že predhodno objavljenih amplikonov, ter mednje umestili prepoznavna mesta za restrikcijske encime. V prvem delu smo pri gBlocku s štirimi amplikoni pokazali, da z dPCR lahko določimo integriteto nukleinskih kislin, kar smo potrdili s testiranjem različno fragmentiranih vzorcev. V drugem delu smo za analizo uporabili gBlock s petimi amplikoni, ki je na obeh koncih imel enako tarčno zaporedje (regijo obrnjenih terminalnih ponovitev, ITR), kar posnema strukturo z adenovirusom povezanih virusov (AAV). Ugotovili smo, da ta gBlock ni primeren za analizo z dPCR, ker ne moremo določiti ali ITR signal prihaja iz konca ali začetka gBlocka. Primerjali smo tudi rezultate dveh dPCR sistemov QX ONE in QIAcuity ter ugotovili, da rezultati sovpadajo, manjše razlike opazimo zaradi različnega načina postavljanja baznih mej. Drugi vzrok za odstopanja od pričakovanih rezultatov so naključni lomi krhkih koncev gBlocka ali nepopoln razrez pri pripravi fragmentov. Prikazali smo tudi, da s povečevanjem koncentracije tarč dobimo navidezno boljšo integriteto, ker se lahko več fragmentov razporedi v isto particijo.[J. Deurič]20232023-09-17 07:17:04Magistrsko delo/naloga150425UDK: 57.088.7(043.2)ISBN: 164707587VisID: 230037COBISS_ID: 164707331sl