Optimizacija protokola za določanje ATP7A na celični liniji raka jajčnikov s pomočjo pretočne citometrije.Ažbe, Klara (Avtor) Černe, Katarina (Mentor) rak jajčnikovodpornostATP7Apretočna citometrijaoptimizacijaRak jajčnikov je eden izmed najpogostejših ginekoloških rakov, ki zaradi poznega odkritja pogosto vodi v smrt. Zdravljenje je v napredovalih stadijih velikokrat neuspešno zaradi odpornosti na zdravila na osnovi platine (Pt-BM). Potencialni biooznačevalec za napoved odpornosti na Pt-BM je ATP7A. Na podlagi določanja ATP7A bi lahko izboljšali zdravljenje in preživetje bolnic z rakom jajčnikov. Vendar bi morali pomen določanja izražanja ATP7A dodatno ovrednotiti. Namen diplomske naloge je bil optimizacija protokola za določanje izražanja ATP7A s pretočno citometrijo, ki je občutljiva in zmogljiva metoda. Do sedaj so namreč izražanje ATP7A v celicah raka jajčnikov določali z drugimi metodami, kot so prenos western, qPCR in konfokalna mikroskopija. Ker se prenašalec nahaja predvsem znotraj celice, je za njegovo detekcijo potrebno izvesti intracelularno barvanje, ki pa je časovno in tehnično zahtevno. Zanimalo nas je, če pride do razlik v nivoju izražanja ATP7A med celicami, ki jih najprej gojimo in zamrznjene shranimo, nato pa pred poskusom odmrznemo (v nadaljevanju »zamrznjene celice«) in celicami, ki jih najprej gojimo v celični kulturi in potem, ko jih odlepimo, takoj uporabimo za poskus (v nadaljevanju »rastoče celice«). Poskuse smo izvedli na celični liniji PEO1, ki je bila izolirana iz bolnice z napredovalim rakom jajčnikov. Izvedli smo dva tipa poskusov, tj. na zamrznjenih in rastočih celicah. Ugotovili smo, da predhodna zamrznitev vpliva na proces permeabilizacije in sicer tako, da pri zamrznitvi najverjetneje pride do poškodb membrane in zato hitreje pride do naluknjanja le-te. Med pomembnejše karakteristike celic, ki vplivajo na poskus, spada viabilnost celic, ki mora presegati 90 %. Pomemben dejavnik, ki vpliva na rezultate, je izvajalec poskusa. Določali smo tudi optimalno napetost na citometru, od katerega je odvisna jakost signala. Ugotovili smo, da je bila izhodiščna napetost citometra optimalna. Na osnovi povprečne intenzitete fluorescence in odstotka fluorescentnih dogodkov smo prišli do zaključkov, da na rezultate znotrajcelične ekspresije ATP7A ne vpliva, če analizo s pretočno citometrijo izvedemo na zamrznjenih celicah. Ponovljivost rezultatov znotrajcelične ekspresije ATP7A se je med poskusi in znotraj poskusov na rastočih in zamrznjenih celicah posebej, izkazala za sprejemljivo. Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko sklepamo, da bi lahko v prihodnje izvajali poskuse tako na zamrznjenih kot na rastočih celicah. Optimalno bi bilo narediti štiri paralelke vzorcev znotraj poskusa in poskus štirikrat ponoviti.20232023-09-08 08:05:00Diplomsko delo/naloga149627VisID: 22678COBISS_ID: 170025987sl