Primerjava dveh bakterijskih ekspresijskih sistemov za pripravo mišjega katepsina LZajec Hudnik, Tina (Avtor) Turk, Boris (Mentor) mišji katepsin LCyDisCoRosetta-gamiTBLBBakterijski ekspresijski sistemi, kot je E. coli, so zaradi cenovne dostopnosti, preprostosti, kratkega generacijskega časa organizma in dobro poznane genetike priljubljena izbira pri pripravi rekombinantnih proteinov. Priprava rekombinantnih proteinov v E. coli pa ima tudi določene omejitve, na primer nezmožnost izvajanja posttranslacijskih modifikacij in oteženo zvijanje heterolognih rekombinantnih proteinov, kar pogosto vodi v njihovo agregacijo. Omejitve bakterijskih ekspresijskih sistemov lahko privedejo do neuspešne priprave predvsem evkariontskih proteinov, kar rešujemo z ustreznimi prilagoditvami parametrov priprave. Prilagoditvi, ki nam pogosto omogočata doseganje večjih izkoristkov priprave, sta uporaba specializiranih sevov in izražanje s koekspresijo šaperonov. Tvorba disulfidnih vezi je pri vzpostavljanju pravilne proteinske strukture pogosto stopnja, ki omejuje hitrost, zato smo se v sklopu diplomskega dela odločili primerjati dva bakterijska ekspresijska sistema, ki omogočata lažjo tvorbo disulfidnih vezi v citoplazmi bakterij. V specializiranem sevu Rosetta-gami 2 (DE3) in v klasičnem ekspresijskem sevu BL21 (DE3) pLysS smo pripravili mišji katepsin L, ki v nativni strukturi vsebuje tri disulfidne vezi. Za pripravo v sevu BL21 (DE3) smo uporabili sistem CyDisCo, ki prek koekspresije šaperonov omogoča lažje vzpostavljanje disulfidnih vezi v reducirajočem okolju citoplazme bakterij. Eksperiment smo izvajali v štirih paralelkah, saj nas je poleg vpliva bakterijskega ekspresijskega sistema zanimalo tudi, kako izbira gojišča LB oziroma TB vpliva na uspešnost priprave mišjega prokatepsina L (mpkatL) v nativni obliki. Zapis za proobliko mišjega katepsina L smo s tehniko IVA vstavili v izbran ekspresijski vektor in pripravili protein v obeh izbranih sistemih. Poleg vpliva ekspresijskega sistema smo preverili tudi, kako izbira gojišča vpliva na pripravo izbranega proteina v obeh ekspresijskih sistemih. Pripravljeni mišji prokatepsin L smo izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo, aktivirali in s titracijo aktivnega mesta določili njegovo aktivno koncentracijo. V obeh ekspresijskih sistemih smo uspešno pripravili aktiven mišji katepsin L (mkatL) z nekoliko večjim izkoristkom priprav pri kombinacijah seva Rosetta-gami 2 (DE3) in gojišča LB ter sistema CyDisCo in gojišča TB. Glede na predstavljene rezultate je za nadaljnjo optimizacijo pogojev priprave mišjega katepsina L najbolje uporabiti omenjeni kombinaciji ekspresijskega sistema in gojišča.20232023-09-06 08:00:00Diplomsko delo/naloga149279VisID: 22721COBISS_ID: 167350019sl