Imunske celice v izlivih bolnic s seroznim rakom jajčnika visokega gradusaMiceska, Simona (Avtor) Kloboves Prevodnik, Veronika (Mentor) Škof, Erik (Komentor) serozni rak jajčnika visokega gradusaizliviimunske celicesferoidinapovedni dejavnikiUvod: Serozni rak jajčnika visokega visokega gradusa (ang. high grade serous ovarian cancer, HGSC) je najpogostejši in najbolj agresiven histološki tip raka jajčnika. Običajno ga odkrijemo v napredovalem stadiju bolezni z izlivi v telesne votline, ki so pogosto prvi znak bolezni. Kljub napredku v diagnostiki in zdravljenju, se preživetje bolnic v zadnjih letih ni izboljšalo. Bioloških označevalcev s katerimi bi lahko zanesljivo napovedali potek bolezni in odgovor na zdravljenje zaenkrat še nimamo. V doktorski nalogi smo želeli preučiti tumorske sferoide ter imunske celice (ki sestavljajo tumorsko mikrookolje v izlivih bolnic s HGSC) kot potencialne napovedne dejavnike poteka bolezni, ovrednotiti izražanje PD-1 (receptor celične smrti 1) in PD-L1 (ligand PD-1) na imunskih in tumorskih celicah ter določiti morfološke, imunofenotipske in molekularne značilnosti tumorskih celic za takojšno in zanesljivo citopatološko diagnostiko. Cilji: V sklopu raziskave smo zastavili tri glavne cilje: 1) kvantificirati različne imunske celice v izlivih bolnic s HGSC in izražanje PD-1 in PD-L1 ter opredeliti njihovo napovedno vrednost preživetja; 2) opisati tumorske sferoide v izlivih, s poudarkom na njihovih morfoloških značilnostih, sestavi celic (tumorskih, imunskih in endotelijskih celic) ter izražanju PD-1 in PD-L1; 3) oceniti zanesljivost citopatologije za določanje imunofenotipskih značilnosti tumorskih celic in mutacij BRCA1/2 iz izlivov HGSC. Metode: V raziskavo smo vključili bolnice s histološko potrjenim HGSC in malignim izlivom. S pretočno citometrijo smo določili prisotnost (delež) različnih imunskih celic v izlivih: limfociti T (CD3+ in njihovih podskupin CD4+, CD8+), regulatorni limfociti T (Treg), NK T celice, CD103+ limfociti T, limfociti B, NK celice, makrofagi in dendritične celice ter izražanje PD-1 in PD-L1. Nizek in visok delež imunskih celic smo opredelili na osnovi mediane. Poleg tega smo v ramazih pobarvanih po Giemsi ocenili velikost in gostoto tumorskih sferoidov, določili mejno vrednost za razlikovanje bolnic z nizko in visoko gostoto tumorskih sferoidov, ki lahko napove boljše oz. slabše preživetje. Na citoblokih smo z imunocitokemijo (ICK) določili celično sestavo sferoidov. Poleg tega smo opazovali tudi izražanje PD-1 in PD-L1. Rezultate pretočno-citometrične analize imunskih celic in ICK analiz sferoidov smo uporabili za izračun morebitne korelacije s preživetjem brez napredovanja bolezni (ang. progression-free survival, PFS) ter celotnim preživetjem (ang. overall survival, OS). Na citospinih in citoblokih smo izvedli ICK barvanje za označevalce, značilne za HGSC histotip: PAX8, WT1, P53, P16 in Ki-67. S sekvenciranjem nove generacije (ang. next-generation sequencing, NGS) smo določili prisotnost zarodnih ali somatskih mutacij BRCA1/2 v izlivih. Rezultate ICK in NGS smo primerjali z rezultati imunohistokemije (IHK) in NGS iz vzorcev tkiva primarnega tumorja ter vzorcev krvi. Rezultati: Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da so limfociti T prevladujoče imunske celice v izlivih (mediana 51%), medtem ko je drugih imunskih celic bistveno manj (mediana ?10%). PD-1 je bil izražen predvsem na limfocitih T (mediana 20%), manjše izražanje pa smo opazili tudi na drugih imunskih celicah. Izražanje PD-L1 nismo zaznani. Bolnice z visokim deležem CD103+ T limfocitov, NK celic, dendritičnih celic in PD-1+ Treg celic so imele statistično značilno boljši PFS in OS kot bolnice z nizkim deležem imunskih celic. Bolnice z visokim deležem CD8+ limfocitov T, makrofagov in PD1+ NK celic ter nizkim deležem CD4+ limfocitov T pa so imele le statistično značilno boljši OS. Poleg tega smo v razmazih pobarvanih po Giemsi opazili majhne, srednje velike in velike sferoide, vendar njihova velikost ni bila povezana s preživetjem. Določili smo 10% mejno vrednost gostote sferoidov, ki je bila povezna s statistično značilno boljšim oz. slabšim PFS in OS. Preučevali smo tudi sferoide v citoblokih, vendar le pri vzorcih, ki so vsebovali velike in številne sferoide. Rezultati ICK so potrdili, da so poleg tumorskih celic v sferoidih tudi limfociti, makrofagi in endotelijske celice. PD-1 je bil v sferoidih izražen predvsem na limfocitih, medtem ko smo opazili izražanje PD-L1 tako na tumorskih celicah kot tudi na imunskih celicah. Korelacije s preživetjem bolnic nismo uspeli pokazati. Rezultati ICC/IHC za PAX8, WT1, P53 in P16 so pokazali zelo dobro korelacijo med citospini, citobloki in tkivnimi bloki (? > 0,75), vendar korelacija za Ki-67 je bila slabša (? < 0,26; p < 0,001). Dodatno smo potrdili 100% korelacijo zarodnih mutacij BRCA1/2, ki so bile določene iz izlivov in primarnega tumorja, vendar to ni bilo opaženo pri somatskih mutacijah. Zaključek: Rezultati doktorske disertacije so pokazali, da imajo vzorci izlivov bolnic s HGSC velik potencial za preučevanje in razvoj novih prognostičnih označevalcev ter so enakovredni tkivnim vzorcem primarnega tumorja za postavitev zanesljive diagnoze HGSC.20232023-07-13 07:15:02Doktorsko delo/naloga147813VisID: 23516sl