Priprava rekombinantnih proteinov heterolizina A in B v bakteriji Escherichia coli in njuna interakcija z umetnimi lipidnimi membranamiHrovatin, Matija (Avtor) Skočaj, Matej (Mentor) Egeroliziniproteini z domeno MACPFheterolizin Aheterolizin BHeterobasidion irregulareumetne lipidne membranerekombinantni proteiniEgerolizini so pretežno β-strukturirani proteini, z molekulsko maso 15-20 kDa, ki prepoznajo in se vežejo na različne lipide oziroma lipidne mešanice. Nekateri egerolizini skupaj s partnerskimi proteini, ki vsebuje domeno, ki napade membrano/perforin (MACPF), tvorijo citolitične komplekse in povzročijo nastanek multimernih transmembranskih por v tarčnih celicah. S pomočjo bioinformatskih analiz smo ugotovili, da tudi bazidiomiceta ameriška rdeča trohnoba (Heterobasidion irregulare) vsebuje egerolizin in protein z domeno MACPF. Egerolizin smo poimenovali heterolizin A (HetA), protein z domeno MACPF pa heterolizin B (HetB). Namen magistrske naloge je bil (i) priprava rekombinantnih proteinov HetA in HetB v bakteriji Escherichia coli, (ii) opis njunih biokemijskih lastnosti, (iii) ovrednotiti, ali se HetA veže na biološke membrane ter (iv) preverjanje njune domnevne porotvorne aktivnost. Medtem ko smo rekombinantni HetA uspeli pripraviti, nam priprava proteina HetB ni uspela. To je bil tudi razlog, da smo za preverjanje porotvorne aktivnosti uporabili proteina pleurotolizin B (PlyB) in pulmolizin B (PulB), ki sta homologa HetB. S pomočjo turbidimetričnega hemolitičnega testa na govejih eritrocitih, s testom zasledovanja sproščanja fluorescenčnega barvila kalceina iz umetnih lipidnih veziklov, ter s testom citotoksičnosti na žuželčji celični linije Sf9 in vitro smo potrdili nastanek porotvornih citolitičnih kompleksov HetA/PlyB in HetA/PulB. Z uporabo površinske plazmonske resonance in sedimentacijskih testov smo dokazali vezavo egerolizina HetA na ceramid fosfoetanolamin in sfingomielin. Zaključimo lahko, da egerolizin HetA v kombinaciji s PlyB ali PulB, izkazuje citolitični potencial, kar bi lahko bilo potencialno uporabno v smislu zaščite rastlin ali v biomedicini.20232023-06-23 07:15:25Magistrsko delo/naloga147084VisID: 217858COBISS_ID: 157137923sl