Priprava usmerjene bakteriofagne knjižnice cikličnih peptidov in afinitetni izbor ligandov človeških imunoglobulinov GGnidovec, Klemen (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Jenko Bizjan, Barbara (Komentor) peptidna knjižnicapredstavitev na bakteriofaguciklični peptidielektroporacijaimunoglobulini GMonoklonska protitelesa so zaradi velike specifičnosti in afinitete vezave pomemben del terapije in diagnostike številnih bolezni. Proizvajamo jih s tehnologijo rekombinantne DNA v sesalskih celicah, ključna pri njihovi izolaciji iz fermentacijske brozge pa je afinitetna kromatografija. Trenutno najbolj uveljavljen afinitetni ligand za izolacijo monoklonskih protiteles je stafilokokni protein A, vendar ta izkazuje številne pomanjkljivosti, zato se raziskave usmerjajo v iskanje novih molekul z afiniteto do človeških imunoglobulinov. Mednje spadajo tudi kratki peptidni ligandi človeških imunoglobulinov G. V magistrski nalogi smo pripravili usmerjeno knjižnico cikličnih peptidov GXYWYCVWFXC, kjer X predstavlja poljubno proteinogeno aminokislino, predstavljenih na površini bakteriofaga M13 v obliki fuzije s plaščnim proteinom p3. Uporabili smo monovalentno predstavitev na osnovi fagmida pIT2-SL. Vanj smo z metodami molekulskega kloniranja vstavil prepoznavno mesto restriktaze AgeI, s čimer smo omogočili izrez insertov, ki kodirajo peptide, pred sekvenciranjem naslednje generacije. Knjižnične fagmide smo v gostiteljske celice dostavili s pomočjo elektrotransformacije. Pripravili smo optimizirana protokola priprave elektrokompetentnih celic seva E. coli TG1 in elektroporacije, ki nam omogočata rutinsko doseganje učinkovitosti transformacije z izoliranim fagmidom v velikostnem razredu 10^7 transformant na µg fagmidne DNA. Učinkovitost transformacije z ligacijsko zmesjo je nižja, zato bi bila za pripravo knjižnic visoke diverzitete potrebna nadaljnja optimizacija postopkov. S sekvenciranjem naslednje generacije smo določili nukleotidna zaporedja cikličnih peptidov, prisotnih v knjižnici pred in po afinitetnem izboru knjižničnih fagov. Analizirali smo pogostost aminokislinskih ostankov na obeh variabilnih mestih v peptidu ter zastopanost posameznih ciklični peptidov v obogateni knjižnici. Po afinitetnem izboru se je v knjižnici na položaju 10 najbolj povečal delež glutamina, ki ga v E. coli TG1 zapisuje tudi zaključni kodon amber. Poleg tega se je v obogateni knjižnici zmanjšal delež hidrofobnih in aromatskih aminokislinskih ostankov ter povečal delež nekaterih polarnih aminokislinskih ostankov na položaju 2. Med cikličnimi peptidi se je po selekciji najbolj povečal delež peptidov GRYWYCVWFQC, GSYWYCVWFQC, GNYWYCVWFQC, GSYWYCVWFGC in GSYWYCVWFEC, katerih afiniteto do človeških IgG bi bilo smiselno primerjalno ovrednotiti v nadaljnjih raziskavah.20232023-06-21 07:45:19Magistrsko delo/naloga147027VisID: 95249sl