​Vpliv koronavirusne bolezni 19 na mrežnico in mrežnično mikrožiljeJevnikar, Kristina (Avtor) Jaki Mekjavič, Polona (Mentor) Cilenšek, Ines (Komentor) COVID-19SARS-CoV-2mrežnicaOCTOCTApolimorfizmiACEACE2AGTR2.Znanstvena izhodišča Marca 2020 je bila razglašena pandemija koronavirusne bolezni 19 (COVID-19), ki jo povzroča virus SARS-CoV-2. Bolezen primarno prizadane respiratorni sistem, najpogosteje v obliki hude obojestranske pljučnice, v sklopu okužbe pa so lahko prizadeti številni organski sistemi (Guan et al., 2020). Virus SARS-CoV-2 v celico vstopa z vezavo na angiotenzin konvertazo 2 (ACE2), ki se nahaja na površini gostiteljevih celic (Hoffmann, Kleine-Weber et al. 2020). ACE2 je prisotna v številnih tkivih, vključno s pljuči, ledvicami, srcem, krvnimi žilami, veznico, roženico in mrežnico (de Figueiredo et al., 2020). V mrežnici je izražena v žilnem endotelu v Müllerjevih celicah in v nevronih notranje jedrne plasti (Piippo, Korhonen et al. 2018, Hoffmann, Kleine-Weber et al. 2020). Z vezavo na ACE2 SARS-CoV-2 zmanjša njeno aktivnost, kar vodi v kopičenje angiotenzina II v serumu in s tem vazokonstrikcijo, vnetje, fibrozo, endotelno disfunkcijo, mikrovaskularne tromboze in nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) (de Almeida-Pititto, Dualib et al. 2020). Izrazit vnetni odziv s hiperproduckijo vnetnih citokinov in kemokinov (npr. TNF- ?, IL-1ß in IL-6) lahko vodi v citokinsko nevihto in večorgansko prizadetost (Guan, Ni et al. 2020). Predpostavlja se, da kombinacija izrazitega vnetnega odgovora in okvare endotela povzroča hiperkoaguabilno stanje, ki bolnike predisponira za trombembolične zaplete, ki bi se lahko odražali tudi na mrežnici. Disregulacija sistema renin-angiotenzin-aldosteron in s tem spremenjeno razmerje med ACE in ACE2 naj bi vplivalo na potek, resnost ter izid COVID-19. Zato bi lahko s polimorfizmi genov za ACE, ACE2 in AGTR2 pojasnili, zakaj imajo nekateri posamezniki brez drugih pridruženih bolezni hujši potek COVID-19 (Asselta, Paraboschi et al. 2020, Devaux, Rolain et al. 2020, Hou, Zhao et al. 2020, Zheng and Cao 2020, Abobaker, Nagib et al. 2021). Polimorfizem rs4646994 gena za ACE je funkcionalni polimorfizem, ki ga najdemo na intronu 16 v obliki insercije in/ali delecije (I/D) 289 baznih parov (Alu sekvence) (Zmorzynski, Szudy-Szczyrek et al. 2019). Za raziskovanje tega polimorfizma smo se odločili, ker izsledki dosedanjih raziskav kažejo, da naj bi vplival na resnost bolezni, medtem ko naj bi imeli nosilci genotipa D/D večje tveganje prizadetosti pljuč in nastanka pljučne embolije v sklopu okužbe s SARS-CoV-2 v evropski populaciji (Howe, Achuthan et al. 2020). Polimorfizem rs2285666 (8790 G/A) na genu za ACE2 se nahaja na začetku introna 3. Čeprav v dosedanjih raziskavah niso uspeli dokazati povezave med prisotnostjo polimorfizma rs2285666 in težjim potekom COVID-19, smo ga zaradi udeleženosti ACE2 v patogenezi COVID-19 vključili v raziskavo. Polimorfizem rs1403543 v genu za AGTR2 (1332A/G) se nahaja na intronu 1. Polimorfizem rs1403543 smo izbrali, ker so v objavljenih raziskavah predpostavljali, da bi lahko bil povezan z večjim premerom arteriol v mrežnici (Liu, Kuznetsova et al. 2011). Namen V raziskavi smo z uporabo optične koherentne tomografije (OCT) in OCT angiografije (OCTA) želeli ugotoviti, ali virus SARS-CoV-2 prizadene mrežnico pri bolnikih s COVID-19 in brez pridruženih bolezni, ki bi lahko vplivale na mrežnico in mrežnično mikrožilje. Želeli smo raziskati tudi vpliv izbranih polimorfizmov v genih anigotenzin konvertaze (ACE), anigotenzin konvertaze 2 (ACE2) in angiotenzin II receptorja tipa 2 (AGTR2) ter njihovo povezavo s prisotnostjo mrežničnih sprememb. Metode V raziskavo smo vključili bolnike v akutni fazi COVID-19, hospitalizirane v diagnostično-terapevtskem centru UKC Ljubljana, in brez pridruženih bolezni, ki bi se lahko odražale tudi na mrežnici. Primerjali smo jih s kontrolno skupino zdravih, po starosti ujemajočih se preiskovancev. Bolnike s COVID-19 smo glede na potek bolezni v skladu z uveljavljeno klasifikacijo bolezni razdelili v dve skupini (tj. blažji oz. težji potek). V skupino z blažjim potekom smo uvrstili asimptomatske bolnike in bolnike z blago obliko bolezni, ki so imeli simptome in znake COVID-19 brez kratke sape, dispneje ali nenormalne slikovne preiskave pljuč. V skupino s težjim potekom smo uvrstili bolnike, ki so imeli glede na klinično oceno ali slikovne preiskave okužbo spodnjih dihal in so potrebovali zdravljenje s kisikom. Iz dokumentacije bolnikov smo povzeli demografske podatke, laboratorijske izvide in potek zdravljenja. V prvem delu raziskave smo z uporabo multimodalnih slikovnih metod (fotografije očesnega ozadja, OCT, OCTA, Topcon DRI OCT Triton, Topcon, Inc, Tokyo, Japonska) opredelili vpliv COVID-19 na mrežnico in na mrežnično mikrožilje. V analizo smo vključili oko z boljšim indeksom kakovosti slike. Na fotografijah očesnega ozadja smo ocenjevali prisotnost mrežničnih krvavitev, mehkih eksudatov ter razširjenih in zvijuganih mrežničnih žil. Premer mrežničnih žil smo analizirali s prej opisano metodo (Invernizzi et al., 2020), pri čemer smo uporabili programsko opremo ARIA (angl. Automated Retinal Image Analyser, ARIA, V1-09-12-11), dostopno na odprtokodni platformi MATLAB (MathWorks Inc., Natick, MA, ZDA). Za izračun srednjega premera ven (angl. mean vein diameter, MVD) in srednjega premera arterij (angl. mean artery diameter, MAD) smo uporabili premere žil štirih glavnih ven in štirih glavnih arterij. Slike OCT in OCTA so bile samodejno segmentirane z vgrajeno programsko opremo (Topcon Corp., Tokio, Japonska). Na slikah smo ocenjevali pravilnost segmentacije in jo po potrebi ročno prilagodili. Debelino sloja RNFL in sloja GCL smo ocenjevali v štirih kvadrantih: zgornjem kvadrantu (angl. superior, S), spodnjem kvadrantu (angl. inferior, I), nazalnem kvadrantu (angl. nasal, N) in temporalnem kvadrantu (angl. temporal, T) notranjega (3 mm) in zunanjega obroča (6 mm) mreže zgodnjega zdravljenja diabetične retinopatije (angl. early treatment diabetic retinopathy study, ETDRS). Slike povrhnjega kapilarnega pleteža (angl. superficial capillary plexus, SCP) in globokega kapilarnega pleteža (angl. deep capillary plexus, DCP) ter fovealne avaskularne cone (angl. foveal avascular zone, FAZ) smo analizirali s pomočjo odprtokodne platforme MATLAB (MathWorks Inc., Natick, MA, ZDA) z uporabo validirane, predhodno objavljene metode (Díaz et al., 2019). Najprej smo določili središče FAZ in nato na središče FAZ superponirali krog ETDRS ter izračunali gostoto kapilarnega žilja v štirih kvadrantih znotraj 3 mm kroga okoli središča FAZ. Vsak kvadrant smo ločeno binarizirali z metodo Otsu (Nicolo et al., 2017). Gostoto kapilarnega žilja smo izrazili v odstotkih, izpeljanih iz razmerja med celotno površino žilja (bele slikovne pike) in celotno površino analizirane regije (število slikovnih pik v kvadrantu) z metodo, ki so jo opisali Nicoló et al. (Nicolo et al., 2017). Pri kvantitativni analizi smo uporabili povprečne gostote žil SCP in DCP. V drugem delu raziskave smo z multimodalnimi slikovnimi metodami opredelili vpliv dolgotrajnih posledic COVID-19 na mrežnico in na mrežnično mikrožilje, pri čemer smo primerjali mrežnične spremembe v akutni fazi COVID-19 ter eno leto po odpustu iz bolnišnice ter slike analizirali na opisani način. V tretjem delu raziskave smo analizirali vpliv izbranih polimorfizmov v genih za ACE (rs4646994), ACE2 (rs2285666) in AGTR2 (rs1403543) na resnost poteka COVID-19 in njihovo povezavo s prisotnostjo COVID-19 retinopatije. DNK smo izolirali v Raziskovalnem laboratoriju za histologijo in genetiko ateroskleroze in mikrovaskularnih bolezni Inštituta za histologijo in embriologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Postopek izolacije DNK iz 200 µl krvi smo opravili s kompletom QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) (Qiagen GmbH, Hilden, Nemčija). Izbrane polimorfizme smo določili z metodo verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času. Statistično analizo smo opravili s programom R statistical software (version 4.1.3, R Development Core Team, Vienna, Austria). Uporabili smo ustrezno korekcijo za multiplo testiranje (Benjamini-Hochbergov postopek) in kot statistično značilno upoštevali vrednost p, manjšo od 0,05 (p < 0,05). Rezultati V prvi del raziskave smo vključili 75 bolnikov v akutni fazi COVID-19 brez pridruženih bolezni ter jih primerjali s 101 preiskovancem iz starostno primerljive kontrolne skupine. Na slikah očesnega ozadja so bile vidne sledeče spremembe: mrežnične krvavitve pri 5 bolnikih (8,5 %), mehki eksudati pri 3 bolnikih (4,0 %) in širše vene pri 50 bolnikih (66,6 %) bolnikih. Mrežnične spremembe so bile bolj pogoste v skupini bolnikov s hudo boleznijo (p = 0,006). Bolniki s težjim potekom bolezni so imeli tudi statistično značilno povečan premer mrežničnih ven (Coef. = 19,28; 95% CI: 7,34–31,23; p = 0,002) in mrežničnih arterij (Coef. = 11,07; 95% CI: 0,84–21,67; p = 0,044). Debelina žilja ni bila povezana z nobeno od spremenljivk (starost, spol, zdravljenje s kisikom, LDH, feritin). Bolniki s težjim potekom bolezni so imeli z OCT izmerjen značilno debelejši sloj živčnih vlaken (angl. retinal nerve fiber layer, RNFL) v zgornjem in spodnjem kvadrantu parafoveolarno (S: p = 0,046; I: p = 0,016) in perifoveolarno (S: p = 0,026; I: p = 0,014). Ob tem so imeli tudi značilno debelejši sloj gangljiskih celic (angl. ganglion cell layer, GCL) v zunanjem temporalnem kvadrantu (p = 0,038). Med skupinama bolnikov s COVID-19 ter zdravimi preiskovanci ni bilo razlik v gostoti povrhnjenga ali globokega kapilarnega pleteža, merjenih z OCTA. Poleg tega tudi ni bilo razlik v velikosti ali obliki fovealne avaskularne cone. V drugi del raziskave smo vključili 30 bolnikov v akutni fazi COVID-19, v starosti 18–65 let, brez znanih pridruženih sistemskih bolezni. Z uporabo multimodalnih slikovnih metod (fotografije očesnega ozadja, OCT in OCTA, Topcon DRI OCT Triton, Topcon, Inc, Tokyo, Japonska) smo primerjali mrežnične spremembe v akutni fazi COVID-19 ter eno leto po odpustu iz bolnišnice. Povprečni premer ven se je po enoletnem spremljanju s 134,8 µm v akutni fazi zmanjšal na 112,4 µm (p < 0,001). Leto kasneje je prišlo tudi do značilnega stanjšanja RNFL v spodnjem kvadrantu notranjega ETDRS obroča (p = 0,047) ter v spodnjem kvadrantu (p < 0,001), nazalnem kvadrantu (p < 0,001) in zgornjem kvadrantu (p < 0,001) zunanjega ETDRS obroča. Med skupinama ni bilo statistično značilnih razlik v gostoti žil povrhnjega kapilarnega pleteža in globokega kapilarnega pleteža. V tretji del raziskave smo vključili 69 hospitaliziranih bolnikov in jih primerjali s 96 zdravimi kontrolami. Skupino bolnikov s COVID-19 smo glede na potek bolezni razdelili v skupino z blažjim potekom bolezni (N = 12) in v skupino s težjim potekom bolezni (N = 57). Bolnike smo glede na prisotnost COVID-19 retinopatije razdelili v dve skupini (Da: N = 50 in Ne: N = 19). Prisotnost genotipa AGTR2 rs1403543-AA je bila pri moških povezana s 3,8-krat večjim tveganjem COVID-19 retinopatije (p = 0,05). Frekvence genotipov v ostalih izbranih polimorfizmih niso bile povezane z resnostjo poteka COVID-19 ali prisotnostjo COVID-19 retinopatije. Zaključek Z raziskavo smo dokazali, da so mrežnične spremembe pogostejše pri bolnikih s težjim potekom COVID-19. Razširitev mrežničnih žilter zadebelitev mrežničnih slojev RNFL in GCL v akutni fazi COVID-19 bi bili lahko biomarkerji sistemske angiopatije pri bolnikih s težjim potekom COVID-19. Z analizo povezave mrežničnih sprememb z izbranimi polimorfizmi smo dokazali, da je tveganje za prizadetost mrežnice večje pri moških z genotipom AGTR2 rs1403543-AA. Prisotnost genotipa AGTR2 rs1403543-AA pri moških bi bila lahko torej genetski dejavnik tveganja za pojav COVID-19 retinopatije. Na podlagi rezultatov raziskave smo torej prepoznali štiri biomarkerje: i) razširitev mrežničnih žil, ii) debelejši sloj RNFL, iii) debelejši sloj GCL in iv) prisotnost genotipa AGTR2 rs1403543-AA pri moških. Z njimi bi v akutni fazi COVID-19 lahko napovedali težji potek bolezni in potencialno večje tveganje sistemske angiopatije. Za oceno morebitnih dolgoročnih zapletov bodo potrebne nadaljnje longitudinalne raziskave.20232023-06-09 07:15:03Doktorsko delo/naloga146719VisID: 23475sl