Rešetanje ligandov aminotransferaze razvejanih aminokislin kot zaviralcev proliferacije glioblastomskih matičnih celicKocijančič, Anja (Avtor) Pišlar, Anja (Mentor) Deo Prakash, Pandey (Komentor) glioblastomrazvejane aminokislineaminotransferaza razvejanih aminokislinnevronske matične celiceV zadnjih desetletjih močno narašča število primerov in smrti zaradi genetskih bolezni, kot je rak. Kljub temu da običajna terapija deluje pri mnogih, je veliko ljudi, ki zbolijo za zelo agresivno vrsto raka ali pa se jim rak povrne. Zanje so nove terapevtske možnosti edini način, s katerim bi lahko ozdraveli. Glioblastom je eden izmed rakov, ki sicer prizadene predvsem starejšo populacijo, lahko pa prizadene tudi mlade ljudi in ima zelo slabo prognozo – le 5–10 % možnosti 5-letnega preživetja. Klasična terapija se je v mnogih primerih izkazala za neučinkovito. Možna razlaga za to leži v celicah, ki so odgovorne za napredovanje in diferenciacijo tumorja. Te celice se imenujejo rakave matične celice in bi lahko bile glavna tarča za razvoj novih terapij tudi pri glioblastomu. Terapije lahko ciljajo na različne lastnosti celic in njihove procese. Ena izmed njih je presnova, ki povezuje vse v celici in se lahko prilagaja okolju, da celica preživi. Rakaste celice številnih vrst raka dokazano uporabljajo te prilagoditve. Pojavijo se lahko pri različnih vejah presnove, vključno s presnovo aminokislin z razvejano verigo (angl. branched-chain amino acids – BCAAs). Aminokisline z razvejano verigo so esencialne aminokisline, ki jih človek pridobi s hrano in razgradnjo beljakovin. Celice glioblastoma in druge rakave celice so v veliki meri odvisne od teh aminokislin, zato lahko zaviranje katerega koli dela njihove presnove prepreči deljenje celic in razraščanje tumorja. V sklopu magistrske naloge smo na enostavnem modelu vrednotili dvanajst ligandov aminotransferaze razvejanih aminokislin (angl. branched-chain amino acid transferase – BCAT), ki sodelujejo v prvem koraku presnove razvejanih aminokislin. Ligandi bi lahko delovali kot zaviralci živčnih matičnih celic, pridobljenih iz tkiva bolnikov z glioblastomom, ter drugih ne-glioblastomskih celičnih linij – HeLa, RPE1, HCT116 in fibroblastov – uporabljenih kot kontrolne celične linije. Pred začetkom glavnega dela naloge smo preverili, kako različno število celic glioblastomskih in HeLa celične linije vpliva na signal testa viabilnosti celic. To smo storili, da smo v nadaljevanju izbrali število celic, ki smo jo uporabili v nadaljnjih poskusih. Ta eksperiment je pokazal, da celice HeLa rastejo hitreje in dajejo močnejši signal po 72 urah, zato je bilo izbrano število celic temu primerno manjše. Na podlagi tega smo v poskusih uporabili 2.000 celic na vdolbinico za celice HeLa in 10.000 celic na vdolbinico za glioblastomske celične linije. Temu je sledila opredelitev izražanja obeh izooblik aminotransferaze razvejanih aminokislin, kar smo storili s pomočjo verižne reakcije s polimerazo v realnem času z reverzno transkriptazo (RT-qPCR). Iz celic smo izolirali RNA, ki smo ga nato z reverzno transkriptazo prepisali v komplementarno DNA, to pa nato uporabili pri qPCR. Za merjenje signala smo uporabili SYBR Green barvilo. Izražanje genov smo kvantificirali relativno glede na izražanje hišnega gena RPLP0. BCAT1 je bil močno in v večini višje izražen kot RPLP0 v vseh glioblastomskih celičnih linijah, vendar pa ne v celicah HeLa. Izražanje BCAT1 se je razlikovalo med linijami, saj linije prihajajo iz tkiv različnih pacientov. BCAT2 je bil izražen v zelo majhnih količinah tako pri vseh glioblastomskih kot pri HeLa celičnih linijah. V RPE1, HCT116 in fibroblastih ni bilo mogoče določiti izražanja nobenega od izooblik encima, saj ni bilo mogoče pridobiti ustreznega vzorca RNA. Glavni del naloge je bilo vrednotenje v obliki enostavnega rešetanja, ki je bilo izvedeno z uporabo plošč s 96-imi vdolbinicami, tako da smo celicam dodali ligande v različnih koncentracijskih območjih. Za ligande 1–4 in 8–11 je bilo uporabljeno koncentracijsko območje 100 µM–0.4 µM, medtem ko so bili štirje ligandi (5, 6, 7 in 12) zaradi slabe topnosti v DMSO preizkušeni v nižjih koncentracijskih območjih, in sicer 50 µM–0.2 µM (ligand 5), 25 µM–0.1 µM (ligand 6), 12.5 µM–0.05 µM (ligand 7) ter 5 µM–0.02 µM (ligand 12). Rešetanje je bilo izvedeno s testom viabilnosti celic PrestoBlue. Iz pridobljenih podatkov smo ocenili približne vrednosti IC50, ki smo jih uporabili za primerjavo učinkovitosti ligandov na celicah. Rešetanje je pokazalo, da liganda 4 in 8 morda delujeta na celice in delno zavirata proliferacijo, zato sta bila uporabljena v nadaljnjih poskusih. Rešetanje v prvem delu naloge je služilo zožitvi nabora ligandov. Z izbranima ligandoma (4 in 8) smo izvedli še preizkus sposobnosti tvorjenja kolonij. Celice smo nasadili v plošče s 6-imi vdolbinicami in v duplikatih dodali DMSO in liganda v prvih petih najvišjih koncentracijah. Čas inkubacije celic je bil dva tedna za glioblastomsko in en teden za HeLa celično linijo. Po tem smo kolonije obarvali s kristalno vijoličnim barvilom in jih vizualno ocenili. Test tvorbe kolonij je bil izveden najprej s celično linijo G7 in HeLa, iz česar je bilo razvidno, da oba liganda bolj vplivata na rast glioblastomske kot HeLa linije, vendar pa je ligand 4 manj vplival na HeLa celično linijo, kar je zaželeno, saj je bila celična linija HeLa uporabljena kot kontrolna. Nastale kolonije smo tudi kvantitativno ovrednotili s pomočjo dilucije barvila v 10-odstotni ocetni kislini in merjenjem absorpcije pri 590 nm na spektrometru. Rezultati se ujemajo z vizualno oceno rasti kolonij. Ob uvedbi celičnih linij RPE1 in HCT116 kasneje pri eksperimentalnem delu naloge je bil test tvorbe kolonij izveden tudi na njima, in sicer z ligandom 4 in z najvišjo koncentracijo 50 µM. Razlog za to je bil, da je v sklopu raziskovanja ligand 4 kazal bolj ugodne rezultate, hkrati pa je koncentracija 100 µM pri obeh celičnih linijah uničila vse celice, zato je bilo ponovno preizkušanje nepotrebno. Ta koncentracijo je bila očitno neoptimalna. Oba liganda sta bila nato vrednotena ponovno s testom viabilnosti na razširjeni paleti celičnih linij, ki je vključevala glioblastomske celične linije (G7, G14, G25, G144 in G166), HeLa, RPE1, HCT116 in fibroblaste. Tudi v tem delu eksperimenta je bil uporabljen test viabilnosti celic PrestoBlue. Iz pridobljenih podatkov smo ocenili približne vrednosti IC50. Te so pokazale, da ligand 8 sicer bolj vpliva na glioblastomske celične linije kot ligand 4, vendar pa istočasno tudi bolj vpliva na kontrolne linije, kar pa ni zaželeno. Na koncu smo z ligandom 4 izvedli še proliferacijski test, s katerim smo želeli opredeliti optimalno koncentracijsko območje delovanja liganda. Za potrebe testa smo 200.000 celic nasadili v vdolbinice na plošči s 6 vdolbinicami in v duplikatu dodali DMSO kot kontrolo in dve koncentraciji liganda – 25 µM in 50 µM. Tretji, šesti in deseti dan smo celice prešteli in jih nazaj zasadili enako število. Rezultati so pokazali, da v vseh testiranih celičnih linijah (G7, G14, RPE1 in HCT116) ligand zavira rast in da ni signifikantnih razlik med glioblastomskimi in kontrolnimi celičnimi linijami. Kljub vsem pridobljenim podatkom nam v sklopu tega eksperimentalnega dela ni uspelo pridobiti podrobnih informacij o tem, kako točno liganda 4 in 8 vplivata na celice in ali dejansko zavirata dotični encim. Za opredelitev tega bi bile potrebne poglobljene dodatne raziskave, ki bi vključevale razširjeno paleto metod, vključno z RNA sekvenciranjem.20232023-03-21 08:45:40Magistrsko delo/naloga144888VisID: 95070sl