Ugotavljanje vpliva izbranih krožnih RNA na cirkadiani ritem celicSlabe, Saša (Avtor) Režen, Tadeja (Mentor) krožne RNAhsa_circ_0095570hsa_circ_0000119cirkadiani ritemRNA vezavni proteiniCirkadiani ali dnevno-nočni ritmi uravnavajo različne biološke procese. Pri evkariontih temeljijo na transkripcijsko-translacijski negativni povratni zanki, sestavljeni iz genov centralne ure. Kratek razpolovni čas mRNA in proteinov vključenih v regulacijo skupaj z izmenjujočimi valovi aktivacije in represije generira cirkadiane oscilacije. Na ravni celice je cirkadiani ritem kompleksno uravnavan, tudi na nivoju RNA. Krožne RNA so skupina nekodirajočih kovalentno zaprtih RNA. Sprva je prevladovalo prepričanje, da je njihov nastanek posledica nepravilnega spajanja eksonov v procesu dozorevanja mRNA. Raziskave so pokazale, da imajo pomembno vlogo v celični biologiji, so stabilnejše, nekatere pa se pojavljajo celo pogosteje od linearnih RNA ekvivalentov. Krožne RNA so povezali že z več fiziološkimi in patofiziološkimi procesi, ne pa še z uravnavanjem cirkadianega ritma. Namen magistrskega dela je bil ovrednotiti potencialen vpliv izbranih krožnih RNA na cirkadiani ritem humane celične kulture. Preko pregleda podatkovnih zbirk smo izbrali 20 kandidatnih krožnih RNA, katerih zapise smo s pristopi molekulskega kloniranja vstavili v vektor pRR in jih čezmerno izrazili v celični liniji U2OS, ki ima dobro ohranjen cirkadiani ritem. V zadnji fazi smo z merjenjem luminiscence spremljali vpliv čezmernega izražanja krožnih RNA na cirkadiano oscilacijo in pridobljene podatke analizirali s prileganjem cosinor modela v programu CosinorPy. Iz začetnega izbora krožnih RNA smo uspešno pripravili konstrukte plazmida pRR z zapisi za pet različnih krožnih RNA, nadalje pa smo v celicah U2OS statistično potrdili izražanje štirih krožnih RNA, za katere smo ovrednotili vpliv na cirkadiano oscilacijo. Nepričakovano smo zaznali vpliv praznega pRR plazmida na cirkadiani ritem celic, katerega natančni vzrok bi bilo potrebno še podrobneje razjasniti. S prileganjem cosinor modela omejenemu naboru pridobljenih podatkov, smo kot najbolj obetavni krožni RNA, ki sta povzročili spremembe v amplitudi cirkadiane oscilacije celic U2OS, opredelili hsa_circ_0095570 iz zapisa za dolgo nekodirajočo RNA H19 in hsa_circ_0000119, ki izhaja iz starševskega gena MAN1A2. Magistrsko delo ponuja osnovo za nadaljnjo optimizacijo postopka transfekcije in metode vrednotenja cirkadiane oscilacije z meritvijo luminiscence, s čimer bi pridobili obsežnejši nabor podatkov, ki bi omogočal zanesljivejše statistično vrednotenje rezultatov. Ob potrditvi vpliva identificiranih najobetavnejših krožnih RNA hsa_circ_0095570 in hsa_circ_0000119 na cirkadiani ritem, bi sledila izvedba funkcijske analize, s katero bi podrobneje opredelili biokemijsko ozadje vpliva na celično cirkadiano oscilacijo.20232023-03-03 08:05:00Magistrsko delo/naloga144607VisID: 20321COBISS_ID: 144750339sl