Uporaba alternativnega izrezovanja intronov za nadzor izražanja proteinovŽvipelj, Mateja (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) Dolinar, Marko (Komentor) izrezovanje intronov in spajanje eksonovalternativno izrezovanjenadzorovano izražanje proteinovkomplementarna zaporedjaAlternativno izrezovanje intronov in spajanje eksonov je aktualna raziskovalna tematika, o kateri je znanega že mnogo, pa vendar kljub številnim novim odkritjem še vedno obstaja precej neznank, ki na to razkritje še čakajo. Opisani so različni naravni mehanizmi tega procesa, mnogi pa so v raziskovalnih delih tudi inženirsko poustvarjeni. V tej magistrski nalogi smo, po zgledu v naravi prisotnih mehanizmov, želeli ustvariti sistem, s katerim bi usmerjali izrezovanje intronov in spajanje eksonov. To pomeni, da bi vplivali na končno obliko zrele mRNA, ki bi iz tako ustvarjenega konstrukta nastala. S tem bi ustvarili sistem za nadzorovano izražanje proteinov, kjer bi iz enega konstrukta omogočili nastanek več proteinov. V ta namen smo pripravili testni (osnovni) sistem treh eksonov in dveh intronov, ta konstrukt pa smo vstavili v plazmidno DNA in izražali v sesalskih celicah. Drugi in tretji ekson tega konstrukta sta vsebovala zapis za fluorescenčna proteina, prvi za protein mCIT, slednji za protein iRFP. V tako osnovanem sintetičnem genu sta omenjena proteina služila kot poročevalna proteina, njuno izražanje pa je bilo odvisno od načinov, na katere je proces izrezovanja in spajanja potekel. Ta osnovni konstrukt smo z uvajanjem novih elementov načrtovano spreminjali. Vpliv teh regulatornih elementov na proces izrezovanja in spajanja in s tem na izražanje obeh proteinov, smo spremljali z merjenjem fluorescence na pretočnem citometru ter z izolacijo in karakterizacijo molekul RNA in proteinov. Z eksperimentom smo želeli preveriti, ali vstavitev izbranih komplementarnih regij v obe intronski zaporedji privede do povečanega izražanja proteina iRFP in zmanjšanega nastanka proteina mCIT. Ugotovili smo, da se sistem odziva na dodane komplementarne regije. Opazno je namreč povišano izražanje proteina iRFP pri konstruktih z daljšimi komplementarnimi regijami, kar nakazuje na povečan delež nastale alternativne oblike mRNA, s katere se ta protein izraža. Obenem pa je videti, kot da se količina mRNA konstitutivne oblike, s katere se izraža mCIT, pri tem ne zmanjšuje kot bi pričakovali. Kljub temu lahko potrdimo, da z uvedbo komplementarnih zaporedij vplivamo na razmerje med dvema proteinoma, ki se izražata z zgoraj opisanega sistema, in da lahko razmerje do neke mere spreminjamo z dolžino tega komplementarnega zaporedja. V nadaljevanju bi bilo zanimivo preveriti, ali bi sedanja zasnova sistema delovala enako, če bi zapisa za fluorescenčna proteina nadomestili z zapisi za druge proteine. Z izgradnjo robustnejšega in zanesljivejšega sistema, ki bi natančno izražal želeno razmerje proteinov glede na vsebovano dolžino komplementarnega zaporedja, bi tak sistem lahko služil kot mehanizem za pripravo multiproteinskih kompleksov različnih proteinov iz enega konstrukta. Na tak način bi denimo lahko ustvarili celične receptorje ali virusne kapside, ki jih tvorijo proteini v različnih razmerjih. Raznovrstnost možnih aplikacij se kaže tudi v tem, da bi tak sistem, z odzivanjem na spremembo dejavnikov v okolici, kjer bi se nahajal, pridobil zanimive terapevtske razsežnosti.20232023-02-28 10:55:00Magistrsko delo/naloga144529VisID: 21661COBISS_ID: 143944707sl