Karakterizacija interakcije med derivatom pirazola in L-treonin dehidrogenazo in sukcinat dehidrogenazo bakterije Escherichia coli.Mikulič Vernik, Nika (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) derivat pirazolaL-treonin dehidrogenazasukcinat dehidrogenazainterakcije protein-mala molekulaprotimikrobno delovanje.Zaradi naraščajoče odpornosti mikroorganizmov proti antibiotikom se mnoge raziskovalne skupine trudijo identificirati biološke makromolekule in metabolne poti znotraj celic mikroorganizmov, ki bi lahko delovale kot tarče za novo odkrite antibiotike. Predhodno smo pokazali, da derivat pirazola 4-(2-aminoetil)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-5-ol zavira rast bakterije E. coli in se veže na proteina L-treonin dehidrogenaza in sukcinat dehidrogenaza v celičnem lizatu. L-treonin dehidrogenaza, ki nima človeškega homologa, sodeluje pri metabolizmu aminokislin in medcelični komunikaciji, celičnih procesih, ki pri prokariontih in evkariontih potekata zelo različno. Katalizira začetni korak pretvorbe aminokisline L-treonin v L-glicin, prav tako pa L-treonin lahko služi kot izhodna spojina za sintezo analogov avtoinduktorja-3, pomembnega za zaznavanje kvoruma. Sukcinat dehidrogenaza je encim citratnega cikla in je za razliko od L-treonin dehidrogenaze prisotna pri E. coli in pri človeku, njena inhibicija lahko vpliva torej tudi na celice gostiteljskega organizma. Namen magistrske naloge je bil podrobneje okarakterizirati interakcije derivata pirazola z obema encimoma. V ta namen smo pripravili rekombinantno L-treonin dehidrogenazo in topni podenoti A in B sukcinat dehidrogenaze v E. coli. Naš primarni cilj je bil ugotoviti, ali spojina deluje inhibitorno na encim L-treonin dehidrogenaza. Aktivnost L-treonin dehidrogenaze v prisotnosti derivata pirazola smo spremljali z merjenjem fluorescence nastajanja produkta NADH. Vezavo male molekule na proteine L-treonin dehidrogenazo ter podenoti A in B sukcinat dehidrogenaze pa smo preverjali z uporabo izotermne titracijske kalorimetrije (ITC). Z uporabo ITC smo ugotovili, da se derivat pirazola veže na obe citosolni podenoti sukcinat dehidrogenaze in na L-treonin dehidrogenazo z afinitetami v mikromolarnem območju. Prav tako je derivat pirazola inhibiral delovanje L-treonin dehidrogenaze predvsem pri koncentracijah substrata, nižjih od Km. Iz tega lahko sklepamo, da gre za linearni kompetitivni mehanizem inhibicije L-treonin dehidrogenaze. Uporabljen derivat pirazola glede na naše rezultate ne deluje tako, kot bi moral delovati antibiotik. Zaradi vezave na sukcinat dehidrogenazo lahko deluje citotoksično za celice gostitelja. Spojina prav tako verjetno deluje kot kelator kovinskih ionov, kar pomeni, da lahko posredno inhibira tudi mnoge druge bakterijske in gostiteljske encime. S testiranjem delovanja analogov spojine bi postopno lahko odkrili molekule z ožjim naborom bakterijskih proteinskih tarč in močnejšo inhibicijo L-treonin dehidrogenaze.20232023-02-22 12:35:00Magistrsko delo/naloga144447VisID: 22343COBISS_ID: 142853891sl