Vpliv piruvat dehidrogenaze in signalne poti STING-TBK1 na uravnavanje energijske presnove z AMP aktivirano protein kinazo v skeletnih mišicahŠkorja Milić, Nives (Avtor) Pirkmajer, Sergej (Mentor) AMPKpiruvat dehidrogenaza kinazadikloroacetatsignalna pot cGAS-STING-TBK12'3'-cGAMPDMXAAaktivatorji AMPKinzulinskeletnomišične celiceiz iPSC-razvite skeletnomišične celicerakave celiceNAMEN: Splošni namen doktorske disertacije je bil preučiti molekularne mehanizme, prek katerih skeletne mišice uravnavajo delovanje z AMP-aktivirane protein kinaze (AMPK) v fizioloških in patofizioloških stanjih, katerih posledica je indukcija imunskega odziva. Poleg tega je bil cilj pojasniti tudi molekularne mehanizme, prek katerih farmakološki modulatorji metabolizma vplivajo na AMPK v skeletnih mišicah. Specifični cilji so bili: (1) opredeliti molekularne mehanizme, prek katerih dikloroacetat (DCA) vpliva na piruvat dehidrogenaza kinazo 1 (PDK1) in AMPK v presnovno različnih tipih celic; (2) raziskati, kako aktivacija signalne poti STING-TBK1 vpliva na presnovni status celic in delovanje AMPK in (3) preučiti vlogo AMPK pri vplivu signalne poti STING-TBK1 na delovanje inzulina v skeletnomišičnih celicah. HIPOTEZE: Preverili smo tri hipoteze: (1) Dikloroacetat zniža raven kinaze piruvat dehidrogenaze in spodbudi aktivacijo AMPK v skeletnomišičnih celicah. (2) Signalna pot STING-TBK1 zavira delovanje AMPK v skeletnomišičnih celicah. (3) Farmakološka aktivacija AMPK zmanjša s TBK1 spodbujeno inzulinsko rezistenco v skeletnomišičnih celicah. METODE: Za raziskovanje molekularnih procesov povezanih s presnovnimi odzivi smo uporabili in vitro modele skeletne mišice (primarne (hSkMC) in iz induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC)-razvite človeške skeletnomišične celice (id-SkMC) ter podganje (L6) skeletnomišične celice). Diferenciacijo skeletnomišičnih celic, razvitih iz iPSC, smo spremljali z RT-qPCR, imunofluorescenco in odtisom western. Za preučevanje odziva tarčnih proteinov in analizo celične signalizacije smo uporabili molekularnobiološke metode (odtis western, RT-qPCR, gensko utišanje z metodo siRNA, ELISA in Magnetic Luminex test za analizo citokinov). Vpliv farmakoloških učinkovin na presnovne procese smo določali s pomočjo analize tvorbe laktata in privzema glukoze. REZULTATI: Ad H1: Napačno delovanje PDK je povezano s presnovnimi motnjami, sladkorno boleznijo tipa 2, debelostjo in rakom. Neposredno z inhibicijo delovanja PDK in posredno z zaviranjem transkripcije gena za PDK1, DCA spodbuja delovanje kompleksa piruvat dehidrogenaze (PDC) in izboljša presnovno homeostazo. Tretiranje z DCA je povzročilo selektiven upad proteina PDK1 v presnovno različnih tipih celic, kar ni bilo povsem odvisno le od regulacije transkripcije. Pri dodatnih posttranskripcijskih mehanizmih, prek katerih je DCA deloval, AMPK ni imela bistvene vloge. Ad H2: Debelost in sladkorna bolezen tipa 2 sta povezana s kroničnim vnetjem. V adipocitih lahko pride do indukcije vnetja tudi zato, ker debelost spodbuja sprostitev mitohondrijske DNA v citosol in posledično aktivacijo signalne poti cGAS-STING-TBK1. V človeških skeletnomišičnih celicah in cevčicah L6 smo signalno pot STING-TBK1 aktivirali z eksogenim 2'3'-cGAMP oziroma z aktivatorjem proteina STING, DMXAA. Aktivacija signalne poti STING-TBK1 je povzročila povečanje aktivnosti AMPK. Ad H3: Z debelostjo povezano kronično vnetno stanje prispeva k razvoju inzulinske rezistence. cGAMP in TBK1 spodbudita aktivacijo protein kinaze B (Akt), ki je glavna kinaza v inzulinski signalni poti. 2'3'-cGAMP je v človeških skeletnomišičnih celicah razvitih iz iPSC stimuliral aktivacijo Akt, DMXAA pa je v cevčicah L6 zavirala z inzulinom spodbujeno aktivacijo Akt in privzem glukoze. Aktivacija AMPK z AICAR je dodatno povečala, medtem ko je posredna inhibicija AMPK s STO-609 preprečila s TBK1-posredovane učinke. ZAKLJUČKI: (1) DCA selektivno zmanjša raven proteina PDK1 in PDK2 ter inducira aktivacijo AMPK v cevčicah L6, kar potrjuje našo prvo hipotezo. (2) Skeletnomišične celice imajo funkcionalno signalno pot cGAS-STING-TBK1, katere aktivacija spodbudi delovanje AMPK, kar ne podpira druge hipoteze. (3) Čeprav 2'3'-cGAMP in DMXAA različno vplivata na inzulinsko signalno pot, je funkcionalna AMPK bistvena za učinke navzdol od TBK1 v skeletnomišičnih celicah. Farmakološka aktivacija AMPK okrepi učinke, posredovane s TBK1, kar ne podpira tretje hipoteze.20232023-02-12 07:15:07Doktorsko delo/naloga144291VisID: 23101COBISS_ID: 146519043sl