​Protitumorsko delovanje genskega elektroprenosa plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 in obsevanja na mišjih modelih karcinomaBožič, Tim (Avtor) Čemažar, Maja (Mentor) Markelc, Boštjan (Komentor) KemokiniCCL5CCL17genski elektroprenosradioterapijamišji modeli karcinomovZnanstveno izhodišče: V zadnjih letih se z razvojem novih tarčnih in genskih terapij spreminjajo tudi načini zdravljenja raka, vendar pa standardni pristopi, kot sta kemoterapija in radioterapija, v večini primerov še vedno veljajo za zlati standard. Posledično so osnova predkliničnih študij standardni pristopi, ki so kombinirani z drugimi terapijami, med njimi tudi genskimi, z namenom povečanja protitumorskega učinka. Med genske terapije spada tudi genski elektroprenos (GET), kjer z dovajanjem električnih pulzov omogočamo lokalno dostavljanje plazmidne DNA v celice različnih tkiv. Tako lahko dosežemo tudi vnos plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 in CCL17 v tumorje, ki se nato izražata v transfeciranih celicah in kot vnetna kemokina sprožita imunski odziv. Čeprav je bila genska terapija z GET različnih citokinov že opisana v literaturi, ostajata kemokina CCL5 in CCL17 z opisano metodo vnosa v tumorje še neraziskana. Številne študije namreč kažejo pomembno vlogo vnetnih kemokinov CCL5 in CCL17 pri usmerjanju celic T ubijalk (CD8+) in drugih imunskih celic v tumorsko mikrookolje. Povečana infiltracija imunskih celic v tumor sama po sebi ne vodi vedno v aktivacijo imunskega odziva in posledično protitumorskega učinka; genska terapija s kemokinoma je lahko zato učinkovita le v kombinaciji s terapijo, ki aktivira imunski odziv. Ena izmed takih terapij je radioterapija. Namen doktorske naloge je bil raziskati protitumorsko delovanje GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 in CCL17 na ravni tumorskih celic in tumorskih modelov karcinoma pri laboratorijskih miših. Raziskali smo neposredni učinek plazmidov z zapisom za kemokina CCL5 in CCL17 na tumorske celice, vpliv na izražanje različnih citokinov v tumorskih celicah in tumorjih po terapiji ter imunološki učinek terapij in vitro ter in vivo. Z navedenimi raziskavami smo želeli razširiti obstoječe znanje o mehanizmih delovanja kemokinov CCL5 in CCL17 po GET ter raziskati učinkovitost te terapije kot dopolnilne imunoterapije v kombinaciji z obsevanjem tumorjev. Metode: V prvem sklopu doktorske naloge smo določili vpliv in vitro lipofekcije celic s plazmidno DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 na viabilnost in izražanje genov izbranih citokinov pri mišjih celičnih linijah raka debelega črevesa CT26 in MC38, ter mišjih celičnih linijah raka dojke 4T1 in E0771. Viabilnost smo določili tako, da smo pritrjenim celicam 24 ur po nasaditvi dodali mešanico plazmidne DNA z zapisom za kemokin CCL5 ali CCL17 in lipofektamina, ki omogoči transfekcijo (oziroma lipofekcijo) celic. Po 48 urah smo učinek transfekcije preverjali s pomočjo testa viabilnosti PrestoBlue?. Vzporedno smo tretiranim celicam po 48 urah izolirali RNA in določili raven izražanja citokinov Ccl5, Ccl17, Cxcl9, Cxcl10, Il-1b, Il-6, Il-12?, Il-18, Ifn-?, Ifn-ß in Tnf-? z metodo kvantitativnega PCR v realnem času (qRT-PCR). Ker smo v nadaljevanju terapijo s kemokini kombinirali z obsevanjem, smo okarakterizirali tudi preživetje izbranih celičnih linij CT26 in 4T1 po lipofekciji s plazmidno DNA z zapisom za kemokin CCL5 ali CCL17 in različnimi dozami obsevanja s testom klonogenosti, ki je standardni test za določevanje radioobčutljivosti. Z linearno-kvadratnim modelom smo določili razmerje ?/ß ter nato izračunali inhibitorne doze IC10, IC50, IC90. V naslednjem sklopu raziskave smo določevali kemotaktične lastnosti kemokinov CCL5 in CCL17. In vitro smo s testoma kemotakse, Boydenovo komoro (angl. Boyden chamber) in z inserti s štirimi vdolbinicami (angl. Culture-Inserts 4 Well), spremljali migracijo mišjih makrofagov RAW264.7 in mišjih celic T ubijalk CTLL-2 proti kemokinskemu gradientu, ki ga vzpostavijo tumorske celice po lipofekciji s plazmidno DNA z zapisom za kemokin CCL5 ali CCL17. Pri obeh testih kemotakse smo imunske celice predhodno označili s fluorescenčnim barvilom CellTrace? CFSE Dye in njihovo migracijo določevali z enkratnim ali večkratnim zajemom slik z napravo Cytation 1. In vivo smo ovrednotili ekstravazacijo imunskih celic po GET plazmidne DNA z zapisom za CCL5 ali CCL17 z uporabo modela dorzalnega okna na mišjem modelu raka debelega črevesa CT26 in raka dojke 4T1. Štiriindvajset ur po namestitvi dorzalnega okna smo tumorje inducirali s podkožnim injiciranjem celične suspenzije, ki je vsebovala 3x105 celic CT26-GFP (celice CT26, ki stabilno izražajo zeleni fluorescirajoči protein (GFP)) ali 4T1-GFP (celice 4T1, ki stabilno izražajo GFP). Terapijo smo izvedli, ko je premer tumorjev dosegel 4 mm. Po intratumorskem injiciranju 5 µL suspenzije plazmidne DNA (2 µg/µL) z zapisom za CCL5 ali CCL17 smo z generatorjem električnih pulzov ELECTRO Cell B10 dovedli električne pulze, ki se uporabljajo pri elektrokemoterapiji (ECT pulzi - 8 pulzov, 1300 V/cm, 100 µs, 1 Hz) s ploščatimi elektrodami z razmakom 4 mm med elektrodama. Po 48 urah smo mišim intravensko injicirali splenocite, izolirane iz vranice zdravih donorskih miši. Splenocite smo pred injiciranjem predhodno označili s fluorescenčnim barvilom CellTracker? CM-DiI Dye. S konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM800 smo nato 24 in 48 ur po injiciranju fluorescenčno označenih splenocitov zajeli 3D slike tumorjev. Protitumorski učinek GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 smo določili na tumorskima modeloma CT26 in 4T1 s spremljanjem zaostanka v rasti podkožnih tumorjev po terapiji. Tumorje smo inducirali s podkožnim injiciranjem 100 µL celične suspenzije, ki je vsebovala 3x105 celic CT26 ali 4T1. Ko so tumorji dosegli velikost 50 mm3 smo začeli s terapijo. Pet minut po intratumorskem injiciranju 25 µL plazmidne DNA (s koncentracijo 1 ali 2 µg/µL) z zapisom za CCL5 ali CCL17 smo z generatorjem električnih pulzov (Cliniporator) dovedli ECT električne pulze s ploščatimi elektrodami z razmakom 6 mm med elektrodama. Zaostanek v rasti smo spremljali z merjenjem treh pravokotnih premerov tumorjev s kljunastim merilom, s katerimi smo po formuli za elipsoid (a × b × c × ?/6; pri čemer a, b in c predstavljajo pravokotne premere) izračunali prostornino tumorjev. Odziv na terapijo smo dodatno ovrednotili z določevanjem infiltracije imunskih celic v tumor z imunofluorescenčnim označevanjem in določevanjem izražanja izbranih citokinov s qRT-PCR. V tem primeru smo mišim odvzeli tumorje tretji in sedmi dan po terapiji. Polovico posameznega tumorja smo uporabili za določitev izražanja Ccl5, Ccl17, Cxcl9, Cxcl10, Il-6, Il-12? in Ifn-? z metodo qRT-PCR, iz druge polovice pa smo pripravili serijo zaledenelih tumorskih rezin, ki smo jih imunofluorescenčno označili s primarnimi in sekundarnimi protitelesi proti površinskim označevalcem celic T pomagalk (CD4+), celic T ubijalk (CD8+), makrofagov (F4/80+) in endotelijskih celic (CD31+). S konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM800 smo nato zajeli slike robov in notranjosti tumorjev ter določili število imunskih celic in površino žil. Kombinirana terapija GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 in radioterapije na tumorskem modelu CT26 in 4T1 je bila izvedena enako kot zgoraj opisana monoterapija s kemokini, le da smo tumorje po GET dodatno obsevali. Pri tem smo uporabili dva obsevalna režima – obsevanje z enkratno dozo 10 Gy in obsevanje s frakcionirano dozo 3x 5 Gy. Pri obeh obsevalnih režimih so tumorji prejeli biološko ekvivalentno dozo ?22 Gy. Z namenom povečanja protitumorske učinkovitosti smo testirali tudi kombinacijo dvakratnega GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 in obsevanja, pri čemer smo drugi GET izvedli 24 ur po zadnjem obsevanju. Pri vseh kombiniranih terapijah smo odziv na terapijo ovrednotili z določevanjem zaostanka v rasti tumorjev, določevanjem infiltracije imunskih celic v tumor z imunofluorescenčnim označevanjem in izražanjem izbranih citokinov s qRT-PCR. V primeru kombinirane terapije smo tumorje za lažjo primerjavo med skupinami odvzeli na tretji dan po zadnjem obsevanju. Raziskave na živalih so potekale v skladu z navodili in dovoljenjem Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano Republike Slovenije (št. dovoljenja U34401-1/2015/17 in U34401-3/2022/11). Za statistično obdelavo podatkov smo uporabili program GraphPad. Vse podatke smo testirali za normalno porazdelitev podatkov. Skupinam z normalno porazdelitvijo podatkov smo določili srednje vrednosti in standardno napako ter ugotavljali statistično značilne razlike med skupinami s testom enosmerne analize variance (One-Way ANOVA) ali t-testom. Podatke, ki niso imeli normalne porazdelitve, smo analizirali z neparametričnimi testi (Wilcoxonov test, Mann-Whitneyjev test in Kruskal-Wallis ANOVA). Rezultati: V prvem delovnem sklopu smo okarakterizirali mišji celični liniji raka debelega črevesa CT26 in MC38, ter raka dojke 4T1 in E0771 na ravni bazalnega izražanja vnetnih citokinov. Nato smo določili vpliv lipofekcije s plazmidno DNA z zapisom za kemokin CCL5 ali CCL17 ter kontrolnim plazmidom pDNA Ctrl na viabilnost celic. Lipofekcija ni vplivala na viabilnost celic, vnos posamezne plazmidne DNA pa je povzročil statistično značilno spremembo v izražanju vnesenih kemokinov kot tudi nekaterih vnetnih citokinov. Določevanje preživetja celic v odvisnosti od doze obsevanja po transfekciji s posamezno plazmidno DNA je pokazalo, da je celična linija CT26 občutljivejša na obsevanje v primerjavi s 4T1. S testi kemotakse in vitro smo določevali stopnjo migracije mišjih makrofagov RAW264.7 in celic T ubijalk CTLL-2 proti tumorskim celicam CT26 in 4T1 po lipofekciji s posamezno plazmidno DNA. Test z Boydenovo komoro je pokazal zmanjšano migracijo makrofagov in celic T ubijalk proti transfeciranim tumorskim celicam CT26 in 4T1 v primerjavi s kontrolo. Pri tem med tretiranimi skupinami nismo opazili statistično značilnih razlik, test kemotakse insertov s štirimi vdolbinicami pa je pokazal povečano migracijo makrofagov proti tumorskim celicam CT26 transfeciranim s plazmidno DNA z zapisom za CCL17 ali CCL5. Povišano migracijo makrofagov smo opazili tudi proti tumorskim celicam 4T1, transfeciranim s plazmidno DNA z zapisom za CCL17, medtem ko je bila migracija proti celicam 4T1, transfeciranim s kontrolno plazmidno DNA ali plazmidno DNA z zapisom za CCL5 precej nižja in primerljiva med skupinama. Kemotaktične lastnosti kemokinov CCL5 in CCL17 smo s spremljanjem ekstravazacije splenocitov določevali tudi in vivo na modelu dorzalnega okna, pri čemer smo po GET obeh kemokinov pokazali, da CCL5 in CCL17 povzročita infiltracijo splenocitov v tumorje CT26 in 4T1. Nato smo ovrednotili protitumorski učinek GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 na mišjih tumorskih modelih CT26 in 4T1 z določevanjem izražanja vnetnih citokinov, stopnjo infiltriranih imunskih celic v tumorje in z določevanjem zaostanka v rasti tumorjev po terapiji. Čeprav je po terapiji prišlo do povišanega izražanja vnesenih kemokinov in spremenjenega izražanja nekaterih vnetnih citokinov, GET s kemokini ni povzročil daljših zaostankov v rasti tumorjev v primerjevi s tumorji po GET s pDNA Ctrl. Nobena izmed terapij tudi ni vodila do popolnih odgovorov. Prav tako pri nobenem tumorskem modelu po terapijah ni bilo značilnih sprememb v številu citotoksičnih CD8+ celic T ubijalk, CD4+ celic T pomagalk in F4/80+ makrofagov v primerjavi s kontrolo. Kombinirano terapijo GET plazmidne DNA z zapisom za kemokina CCL5 ali CCL17 in radioterapije smo na mišjih tumorskih modelih CT26 in 4T1 ovrednotili na enak način kot monoterapijo. Spremembe v izražanju vnetnih citokinov smo v tumorjih CT26 zaznali po vseh kombiniranih terapijah, tudi pri kombiniranih terapijah z GET pDNA Ctrl. V tumorjih 4T1 so kombinirane terapije, ne glede na uporabljeno plazmidno DNA, vodile predvsem do povišanega izražanja gena Ccl5. V primeru 2x GET s 25 µg plazmidne DNA kot monoterapije ali v kombinaciji s frakcioniranim obsevanjem 3x 5 Gy se raven izražanja vnetnih citokinov v obeh tumorskih modelih znatno ni spremenila, z izjemo povečanega izražanja vnesenih kemokinov. Imunofluorescenčno označevanje zaledenelih tumorskih rezin po kombiniranih terapijah je pokazalo spremembe v populacijah CD4+ in CD8+ celic T, pri čemer se je število CD8+ celic T pri obeh tumorskih modelih na robu tumorjev zmanjšalo že po samem obsevanju z enkratno ali frakcionirano dozo. Po kombiniranih terapijah pa je bilo zmanjšanje števila CD8+ celic T v nekaterih primerih tudi statistično značilno v primerjavi s kontrolo. Iz števila popolnih odgovorov in zaostanka v rasti tumorjev CT26, je razvidno, da GET s plazmidno DNA doprinese k protitumorskemu učinku obsevanja ne glede na uporabljeno plazmidno DNA. Nasprotno pa je v neimunogenih tumorjih 4T1 primerjava zaostankov v rasti tumorjev med skupinami pokazala statistično značilno večji protitumorski učinek obsevanja v kombinaciji z GET kemokinov CCL5 ali CCL17 glede na kombinacijo obsevanja in GET s kontrolno plazmidno DNA. Zaključki: V raziskavi smo dokazali, da povečano izražanje kemokinov CCL5 ali CCL17 v transfeciranih tumorskih celicah vpliva na izražanje ostalih vnetnih citokinov. Povečano izražanje je vodilo do migracije makrofagov v primeru testov kemotakse in vitro kot tudi do infiltracije splenocitov v tumorje na modelu dorzalnega okna in vivo. Genski elektroprenos kemokinov CCL5 ali CCL17 vodi do popolnih odgovorov le v kombinaciji z obsevanjem. GET kemokinov in obsevanje vodita do popolnih odgovorov pri imunogenih tumorjih CT26 ne glede na uporabljeno plazmidno DNA. Pri neimunogenih tumorjih 4T1 pa GET kemokinov in obsevanja vodi v značilno daljši zaostanek v rasti tumorjev, kar kaže na doprinos kemokinov k protitumorskemu učinku. Kemokina CCL5 in CCL17 tako predstavljata potencial v imunoterapiji raka, vendar je v primeru kombinirane terapije potrebna nadaljnja optimizacija terapevtskega režima, še posebej v povezavi z imunološkim statusom tumorja.20232023-01-21 07:15:07Doktorsko delo/naloga143943VisID: 23086COBISS_ID: 147767555sl