Razvoj in vrednotenje novih postopkov za radiooznačevanje krvotvornih matičnih celicSočan, Aljaž (Avtor) Gmeiner, Tanja (Mentor) Švajger, Urban (Komentor) nuklearna medicinamatične celiceterapevtska uporabaradiofarmakiradionuklidiZdravljenje z matičnimi celicami je danes v izjemnem vzponu na različnih področjih medicine, predvsem v kardiologiji, nevrologiji in onkologiji. Zaradi omejenih možnosti spremljanja presajenih celic in vivo je spremljanje in ovrednotenje uspešnosti zdravljenja, kljub množici slikovnih in drugih diagnostičnih ter laboratorijskih metod, ki so danes na razpolago, še vedno težavno. Označevanje matičnih celic z različnimi radioizotopi, oz. radiofarmaki, predstavlja primerno nuklearno medicinsko metodo za sledenje celicam in vivo po aplikaciji bolniku. Scintigram – slikovni prikaz prostorske porazdelitve označenih celic v telesu po presaditvi – lahko uporabimo tudi za kvantitativno oceno absolutnega ali relativnega števila celic v interesnem področju, npr. organu, kot je srce. Na področju nuklearno medicinske slikovne diagnostike se za neselektivno označevanje celic (levkocitov, trombocitov) danes rutinsko uporabljajo radiofarmaki, označeni z indijem-111 (8-hidroksikinolin (oksin) in 2-hidroksi-2,4,6-cikloheptatrienon (tropolonat)) in tehnecijem-99m (heksametilpropilenamin oksim oz. HMPAO) ali eksametazim. Oba izotopa ob razpadu izsevata žarke gama s primerno energijo sevanja ter imata ustrezen razpolovni čas za uporabo v medicini. Pri obeh izotopih se v postopku označevanja celic izkorišča lipofilnost kompleksa uporabljanega radiofarmaka, s katerim lahko neselektivno označimo vse celice, ki pridejo v stik. Z indijem-111 označen oksin ([111In][In(oksinat)3]) je bil prvi ligand, ki so ga v nuklearno medicinski diagnostiki uporabljali za označevanje levkocitov. Oksin in tropolonat tvorita z indijem-111 kompleksa v razmerju 3:1, ki sta nevtralna in visoko lipofilna, kar omogoča prehajanje kompleksa preko celične membrane. V celici pride do delne ali popolne disociacije kompleksov in vezave indija-111 na intracelularne beljakovine. S tehnecijem-99m označen HMPAO ([99mTc][Tc(HMPAO)]) je radiofarmak, ki je bil razvit z namenom spremljanja pretoka krvi skozi možgane. Kompleks [99mTc][Tc(HMPAO)] izkazuje visoko lipofilnost, je brez naboja in ima dovolj majhno molekulsko maso, da lahko prehaja preko možgansko krvne bariere. Mehanizem danes izkoriščamo tudi v klinični praksi za radiooznačevanje levkocitov. Po pasivni difuziji primarnega kompleksa skozi celično membrano, se kompleks pod vplivom celičnih encimov pretvori v sekundarni kompleks, ki zaradi nižje lipofilnosti ne more prehajati nazaj in ostane vezan v celici. Za razliko od indija-111 in tehnecija-99m, so galij-68, baker-64 in cirkonij-89 pozitronski sevalci, ki pri razpadu izsevajo pozitrone, kar izkoriščamo pri PET (pozitronska emisijska tomografija) slikovni diagnostiki. 10 krat večja občutljivost, v primerjavi s SPECT (enofotonska emisijska računalniška tomografija), boljša resolucija in lažja kvantifikacija PET omogočajo spremljanje manjših sprememb ter natančnejše spremljanje manjšega števila radiooznačenih celic. 68Ge/68Ga radionuklidni generator omogoča pridobivanje galija-68 na mestu uporabe, kar kljub kratki razpolovni dobi (68 min) ob uporabi avtomatiziranih sinteznih modulov omogoča pripravo z galijem-68 označenih radiofarmakov ustrezne kakovosti za rutinsko klinično uporabo. Baker-64 in cirkonij-89 imata daljši razpolovni dobi (12,7 h in 78,4 h) in sta zaradi možnosti daljšega sledenja označenih molekul v daljšem časovnem obdobju odlična kandidata za radiooznačevanje celic. Vsi našteti radionuklidi, enako kot indij-111, spadajo v skupino koordinacijiskih radiokovin, imajo podobne kemijske lastnosti kot indij-111 in podobno tvorijo komplekse. Vsi omogočajo tvorbo kompleksov z oksinom in tropolonatom, ki jih nato lahko uporabljamo za neselektivno radiooznačevanje celic. Doktorsko delo je razdeljeno na tri vsebinsko povezane sklope. V prvem sklopu obravnavamo glavni namen in cilj doktorskega dela, razvoj in ovrednotenje radiooznačevanja krvotvornih matičnih celic (CD34+). Krvotvorne matične celice (CD34+), pridobljene s stimulacijo kostnega mozga, za katere so v kliničnih študijah dokazali uporabnost za zdravljenje ishemičnih stanj (npr. ishemične bolezni srca) pri ljudeh, ki so neodzivni na standardno farmakološko zdravljenje ali zdravljenje z revaskularizacijo, smo označili z [99mTc](HMPAO)], ki danes v klinični praksi predstavlja zlati standard za radiooznačevanje levkocitov. Ovrednotili smo vpliv radiooznačevanja na fiziološko stanje celic (vpliv na viabilnost celic, citotoksičnost, izplavljanje aktivnosti iz celic). Radiooznačevanje krvotvornih matičnih celic (CD34+) z [99mTc][(HMPAO)] nima vpliva na funkcionalnost označenih celic in po aplikaciji omogoča sledenje in spremljanje vgnezditve celic na želeno mesto z uporabo SPECT. S pridobljenimi podatki lahko z uporabo nuklearno medicinske (NM) slikovne diagnostike pomembno prispevamo k oceni uspešnosti zdravljenja z matičnimi celicami in morebitnim potrebnim spremembam zdravljenja. Uporaba celic, radiooznačenih s pozitronskimi sevalci, je kljub prednostim PET slikovne diagnostike (boljša občutljivost in resolucija, lažja kvantifikacija) omejena. Vzroki so povezani z dosegljivostjo izotopov ki izsevajo pozitrone, ter možnostmi avtomatizirane priprave radiofarmakov ustrezne kakovosti v volumnih dovolj majhnih za radiooznačevanje celic. V drugem sklopu doktorskega dela smo preučili in ovrednotili uporabo avtomatiziranega modula z lastno zaščito, namenjenega popolnoma avtomatizirani pripravi radiofarmakov označenih z galijem-68 in/ali drugimi PET in beta sevalci. Uporaba takšnega modula je nujna za zmanjšanje sevalne obremenitve osebja, ki pripravlja radiofarmake, ter hkrati omogoča pripravo radiofarmakov primerne kakovosti in primernih volumnov. V tretjem sklopu doktorskega dela smo razvili in optimizirali metodo koncentriranja pozitronskih radioizotopov (galij-68, baker-64, cirkonij-89) na anionsko izmenjevalni koloni, radiooznačevanje oksina in tropolonata na koloni ter elucije nastalih kompleksov v fiziološkem mediju, v dovolj majhnih volumnih (manj kot 2 ml) in primernih za radiooznačevanje celic. Razvita metoda bi lahko v prihodnosti omogočala avtomatizirano pripavo radiofarmakov za radiooznačevanje celic. S pripravljenimi radiofarmaki ustrezne kakovosti smo radiooznačili eritrocite in ovrednotili označevanje ter izplavljanje radioaktivnosti iz celic. Na podlagi rezultatov označevanja eritrocitov smo z [64Cu][Cu(tropolonat)2] in [64Cu][Cu(oksinat)2] radiooznačili levkocite in ovrednotili označevanje. Potencialno primernost [64Cu][Cu(tropolonat)2] in [64Cu][Cu(oksinat)2] za nadaljnjo uprabo v klinični praksi smo potrdili tudi na živalskem modelu (BALB/c miši) vnetja in okužbe. [A. Sočan]20192023-01-12 12:34:35Doktorska disertacija143803UDK: 615.849.2:612.419(043.3)COBISS_ID: 302985472sl