Raziskave endokrinih učinkov fenolnih analogov bisfenola A in njihovih mešanic in silico in in vitroKlopčič, Ivana (Avtor) Sollner Dolenc, Marija (Mentor) Mavri, Janez (Komentor) bisfenol Aanalogiidentifikacijazdravilaonesnažilakozmetični preparatimešanicepleiotropni učinkitoksičnostV doktorski disertaciji smo se osredotočili na identifikacijo potencialnih hormonskih motilcev fenolnih analogov bisfenola A (BPA) iz skupin zdravil, onesnažil in kozmetičnih sestavin, na njihovo pleiotropno delovanje ter preučili hormonske učinke njihovih mešanic. Najprej smo preverili zastavljeno hipotezo doktorske disertacije ali je modulacija hormonskega sistema odvisna od kemijske strukture. Med fenolnimi analogi BPA smo identificirali prepoznavne strukturne elemente odgovorne za interakcijo z jedrnimi receptorji.Z metodo in silico smo s pomočjo prosto dostopnega programskega paketa Endocrine Disruptome smo napovedali afiniteto vezave z 12 različnimi jedrnimi receptorji za izbran niz spojin. Predvsem smo se osredotočili na bromirana zaviralca gorenja TBB in TBPH, njunametabolita (TBBA in TBMEPH) ter aminofenolne analoge BPA (diklofenak (DIC), 4- hidroksidiklofenak (4-HD), paracetamol (PAR) in piceatanol (PIC)). Testirali smo jih in vitro na celičnih linijah s poročevalskim genom za luciferazo: MDA-kb2 celični liniji, ki ima izražen glukokortikoidni (GR) kot tudi androgeni receptor (AR), in GH3.TRE-Luc celični liniji z izraženima tiroidnima receptorjema α in β (ΤRα in TRβ). Za spojine, ki so izkazovale glukokortikoidno in androgeno moduliranje, smo izvedli še potrditveni test vezave in vitro. Med prvimi smo za prej omenjene spojine dokazali njihove različne hormonske učinke na estrogenskem (ER), androgenem, glukokortikoidnem in tiroidnem receptorju pri koncentracijah, katerim smo ljudje realno lahko izpostavljeni. Ugotovili smo, da metabolizem neposredno vpliva na modulacijo androgenega, glukokortikoidnega in tiroidnega receptorja. Za modulacijo glukokortikoidnega receptorja so pomembni: prosta karboksilna skupina in 2-(etilheksil)-oksikarbonilna skupina vezani na aromatski obroč ter prisotnost treh halogenih atomov v orto položaju. Rezultati so pokazali, da je antiandrogena aktivnost odvisna od števila karbonilnih skupin v molekuli in stilbenske strukture brez dodatnih stranskih verig med benzenskima skupinama. Ugotovili smo, da afiniteto vezave na androgeni receptor izkazujejo spojine, ki imajo v svoji strukturi Ph-N-C=O fragment, OH in NH-C=O skupini ter aromatski obroč. Na splošno, spojine, ki so bromirane na položaju 3 in 5 na fenilnem obroču glede na osnovni skelet, imajo antitiroidni učinek. Opazili smo, da je Ph-N-Ph fragment, ki vsebuje še atom Cl na enem od fenilnih obročev, prisoten pri spojinah z mešanim agonističnim/antagonističnim delovanjem na androgeni receptor. Ugotovili smo tudi, da hormonski motilci androgenega, glukokortikoidnega, tiroidnega in estrogenega receptorja v svoji strukturi vsebujejo fenolne skupine kot tudi OH skupino v para položaju glede na –R ( v našem primeru R je –NH-Ph fragment, -NH-C=O fragment, -C=CH-Ph fragment) vezane na fenolni obroč ter da so te prav tako odgovorne za hormonsko aktivnost omenjenih spojin. V drugem delu doktorske disertacije smo potrdili hipotezi, da je hormonski učinek proučevanih spojin na zgoraj omenjene receptorje odvisen od hkratne prisotnosti drugih snovi in da imajo fenolni analogi BPA pleiotropni učinek. Poleg modulacije jedrnih receptorjev smo se osredotočili tudi na njihovo genotoksično in imunomodulatorno delovanje. Izvedli smo teste in vitro na LCL celični liniji za aminofenolne analoge BPA v smislu določanja vpliva izbranih spojin na produkcijo citokinov. Rezultati na LCL celični liniji kažejo, da imajo določeni aminofenolni analogi BPA imunomodulatorno delovanje pri koncentracijah, najdenih v človeški plazmi ter da na njega znatno vpliva metabolizem teh spojin. Dokazali smo, da lahko predvsem fenolni analogi BPA kot hormonski motilci glukokortikoidnega receptorja spremenijo imunski odziv izpostavljenih posameznikov. S pomočjo kvantno-kemijskih metod smo prvi predstavili mehanizem direktne poškodbe DNA toksičnega metabolita paracetamola (NAPQI). Paracetamol lahko uvrstimo med aminofenolne analoge BPA (tako kot diklofenak (DIC), 4-hidroksidiklofenak (4-HD) in piceatanol (PIC)). Ugotovili smo, da izkazuje aminofenolni analog BPA paracetamol preko svojega metabolita NAPQI nizko verjetnost genotoksičnosti, ki je možna le v primeru izčrpanih zalog glutationa v celici ter da so kinoniminske strukture manj reaktivne v primerjavi s kinonskimi. Predstavili smo podroben pregled vseh najpogosteje uporabljenih spojin, ki vsebujejo kinonsko in kinoniminsko strukturo ali vsebujejo to skupino njihovi metaboliti, ter posledice izpostavitve tem spojinam. Učinke mešanic izbranih spojin iz skupin onesnažil (propilparaben (PP), butilparaben (BP), dietilheksil ftalat (DEHP) in tetrametrin (TM)) in kozmetičnih sestavin (2-metilrezorcinol (2MR), avobenzon (AVB) in butil-hidroksianizol (BHA)) smo določili na celičnih linijah na enak način kot hormonske učinke posameznih spojin. Testiranja učinka mešanic smo se lotili na dva načina: proučevali smo mešanice izbranih spojin pri koncentracijah izpostavitve človeka (1 μM in 10 nM) ter pri koncentracijah, v katerih spojine izkazujejo 50 % spodbujevalni ali zaviralni učinek na proučevane receptorje (EC50 ali IC50). Glede na dobljene rezultate smo ugotovili, da testirane komponente mešanic interagirajo ena z drugo. Pokazali smo, da učinki mešanic niso zanemarljivi ter da jih je nujno potrebno vklopiti v oceno tveganja hormonskih motilcev na zdravje ljudi in njihovo okolje. Ti rezultati kažejo, da je potrebno natančno določiti strategijo za testiranje mešanic spojin, ki bo temeljila na ustreznih toksikoloških testih (že obstoječe in silico in in vitro metode, novi biološki testi ter Euromix modelna orodja za testiranje mešanic). [I. Klopčič]20162023-01-12 07:33:48Doktorska disertacija143775UDK: 612.43:620.266.1(043.3)COBISS_ID: 286891008sl