Biokemijske lastnosti in delovanje ricinu B podobnega lektina iz gobe Macrolepiota proceraŽurga, Simon (Avtor) Kos, Janko (Mentor) Sabotič, Jerica (Komentor) gliveorjaški dežniklektinirekombinantni proteinibiokemijske lastnostibiološka aktivnostdisertacijeVišje prostotrosnice oziroma njihova plodišča so vir mnogih biološko zanimivih učinkovin, med drugim tudi lektinov. Lektini so proteini, ki specifično in reverzibilno brez kovalentne modifikacije vežejo ogljikove hidrate in imajo pomembno vlogo pri celičnih in medceličnih procesih. V okviru doktorske disertacije smo pripravili rekombinantno obliko lektina, imenovanega MpL, ki je bil izoliran iz gobe orjaški dežnik (Macrolepiota procera). Pripravili smo tudi pet mutant lektina s spremenjenimi vezavnimi mesti in dve njegovi fuziji s proteaznima inhibitorjema klitocipinom in cistatinom C. Iz kristalne strukture lektina smo ugotovili, da gre za ricinu B podoben lektin z β-triperesnim vzorcem zvitja, ki je sestavljen iz treh strukturno podobnih ponovitev: α, β in γ. Lektin vsebuje na α- in γ-ponovitvi dve hipotetični mesti za vezavo sladkorjev. Najmočnejše vezavno mesto je na α-podenoti, kjer smo potrdili vezavo treh ligandov, in sicer galaktoze, laktoze in di-N-acetillaktozamina. V vezavnem mestu na γ-ponovitvi je vezan glicerol, ki deluje kot mimetik galaktoze. Lektin tvori strukturno nedefinirane dimere, dokazane z nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo in premreženjem z glutaraldehidom. Testiranje na glikanskih mikromrežah je pokazalo, da je vezavno mesto na α-ponovitvi lektina najbolj specifično za N-acetillaktozamin (Galβ1,4GlcNAc) in njegove ponovitve, mesto na γ-ponovitvi pa za Galβ1,3GlcNAc. Konstanta disociacije za vezavo mono- in disaharidov je v mikromolarnem območju. Nadalje smo ugotovili, da lektini, med njimi tudi MpL, in proteazni inhibitorji z β-triperesnim vzorcem zvitja iz gob medsebojno interagirajo in vplivajo na medsebojne funkcije z morebitno fiziološko vlogo obrambe gobe pred škodljivci. Lektin MpL se različno izraža v posameznih delih gobe in je najbolj izražen v delih, ki so najbolj izpostavljeni morebitnim škodljivcem. Poleg tega je lektin zelo toksičen za ogorčico Caenorhabditis elegans. Lektin rMpL je toksičen tudi za mutante ogorčice C. elegans, ki imajo spremenjeno oziroma okrnjeno sintezo glikanskih struktur na glikoproteinih in glikolipidih. Za lektin rMpL smo dokazali netoksičnost za različne tipe humanih celic. Lektin vpliva na diferencirane celice histiocitnega limfoma U937 z makrofagnimi lastnostmi, in sicer zmanjša njihovo adhezijo na glikoprotein fibronektin in zveča njihovo adhezijo na fibrinogen. Fluorescenčna analiza celic po dodatku lektina je pokazala, da lektin rMpL aktivno vstopa v celice preko endocitoze s klatrinskimi mešički in se nato preko retrogradnega transporta usmeri v trans-Golgijev aparat. Lektin rMpL smo uporabili kot orodje za vnos proteaznih inhibitorjev v notranjost celice. Fuziji lektina rMpL s proteaznima inhibitorjema klitocipinom in cistatinom C aktivno vstopata v celico na enak način kot nemodificiran lektin rMpL. Tekom našega dela smo temeljito proučili biokemijske lastnosti lektina MpL in njegove biološke aktivnosti. S pripravo in uporabo fuzij lektina s proteaznima inhibitorjema klitocipinom in cistatinom C smo dokazali, da je lektin MpL primeren za ciljano dostavo proteinskih učinkovin v celice.[S. Žurga]20152023-01-11 08:15:08Doktorsko delo/naloga143734UDK: 606:615.322(043.3)COBISS_ID: 279208192sl