Strukturno podprto načrtovanje novih zaviralcev človeške DNA topoizomeraze II[alfa]Pogorelčnik, Barbara (Avtor) Šolmajer, Tomaž (Mentor) Perdih, Andrej (Komentor) farmacevtska kemijaDNA-topoizomeraza tipa IIencimski inhibitorjiprotitumorne učinkovinenačrtovanjekarakterizacijadisertacijeDNA topoizomeraze II spadajo v družino encimov, ki katalizirajo topološke spremembe v molekuli DNA. Človeška DNA topoizomeraza II sprošča dodatno zvito molekulo DNA, poleg tega je zmožna še razvozlanja (unknotting) in razpletanja (decatenation), kar je nujno pri procesih podvajanja in prepisovanja ter rekombinaciji. Prehod med različnimi topološkimi stanji je možen le s cepitvijo ene ali obeh verig dvovijačne molekule DNA, kar omogoči prehod druge molekule DNA skozi pretrgano molekulo DNA. Človeška DNA topoizomeraza IIα je dobro znana in validirana tarča, ki se uporablja za razvoj različnih protirakavih učinkovin. Učinkovine, ki zavirajo aktivnost topoizomeraze IIα, so glede na mehanizem delovanja razdeljene v dve glavni skupini: topoizomerazni strupi (poisons) in katalitični zaviralci (catalytic inhbitors). Topoizomerazni strupi stabilizirajo kovalentni kompleks topoizomeraza II-DNA (cleavable complex) in spremenijo nastali kompleks v močan celični toksin, ki onemogoča nadaljnjo normalno delitev celic. Kar nekaj učinkovin iz te skupine se že uporablja v klinični praksi. V drugo, novejšo skupino, spadajo zaviralci posameznih korakov katalitičnega cikla DNA topoizomeraze IIα. Zaradi stranskih učinkov, predvsem kardiotoksičnosti teh zdravil (topoizomeraznih strupov), je prišlo do potrebe po nadaljnjem razvoju novih in optimizaciji že znanih zaviralcev tega encima predvsem iz nove skupine katalitičnih zaviralcev. V doktorski disertaciji smo se ukvarjali z načrtovanjem in začetno eksperimentalno karakterizacijo več različnih kemijskih razredov novih katalitičnih zaviralcev človeške DNA topoizomeraze IIα, ki se vežejo v vezavno mesto za ATP. Uporabili smo dostopne strukturne podatke o vezavnem mestu za ATP in podatke o obstoječih ligandih, ki so nam služili kot robni pogoji pri iskanju novih spojin s pomočjo različnih metod računsko podprtega načrtovanja učinkovin. Spojine smo okarakterizirali tako na nivoju encimske aktivnosti, kot tudi njihovo sposobnost, da zavrejo rast rakavih celic. V prvi raziskavi smo na podlagi podatkov o vezavi že znanih zaviralcev (spojin, ki imajo v svoji strukturi purinski bicikel) na ATPazno domeno človeške topoizomeraze IIα pripravili farmakoforne modele na osnovi strukture encima in strukture ligandov, ki smo jih uporabili za virtualno rešetanje komercialno dostopnih spojin. Pri rešetanju smo poskušali identificirati nove monociklične spojine kot zamenjave za izhodni purinski bicikel. Odkrili smo serijo 1,3,5-triazinov, novih monocikličnih topoizomeraznih IIα zaviralcev v mikromolarnem v območju. Stabilnost interakcijskega vzorca sidrane poze aktivnega zaviralca smo študirali z molekulsko dinamiko (MD). 1,3,5-triazine, ki so izkazovali zaviralno aktivnost na človeški topoizomerazi IIα, smo ovrednotili še z in vitro MTT testom, s katerim smo pokazali selektivno citotoksičnost spojine na celični kulturi HepG2. V drugi raziskavi smo na osnovi eksperimentalno določene vezave molekule AMP-PNP v vezavnem mestu za ATP postavili farmakoforni model na osnovi strukture, ki smo ga uporabili za virtualno rešetanje knjižnic komercialno dostopnih spojin. Pri tem smo odkrili dve seriji bicikličnih zaviralcev: nove zaviralce s purinsko strukturo in nov strukturni razred s pirazolo pirimidinskim skeletom. Vezavo spojin, ki so izkazovale zaviralno aktivnost na človeški topoizomerazi IIα, smo ovrednotili še z biofizikalnimi metodami. Z metodo površinske plazmonske resonance (SPR) smo pokazali vezavo izbranega zaviralca iz obeh kemijskih razredov na ATPazno domeno in določili Kd vrednosti. Prav tako smo pokazali, da obe spojini zavirata proces razpletanja človeške topoizomeraze IIα (human topoisomerase IIα-mediated decatenation). S simulacijo molekulske dinamike (MD) smo predvidevali, katere interakcije igrajo ključno vlogo pri medmolekulskem prepoznavanju. Natančna analiza molekulske dinamike je nakazala, da je Asn120 najverjetneje ključna interakcija pri vezavi spojin v vezavno mesto za ATP. Dve spojini iz obeh strukturnih razredov sta izkazovali tudi obetavno citotoksično delovanje na celicah človeškega hepatoma (HepG2) in celični liniji adenokarcinoma dojke v fazi metastaze (MCF-7). V tretji raziskavi smo s preiskovanjem sintezne knjižnice molekul z optimiziranimi farmakoforni modeli odkrili novo serijo monocikličnih topoizomeraznih IIα zaviralcev, ki imajo v svoji strukturi 1,3,5-triazin-2(1H)-onski fragment in kažejo izboljšano zaviralno aktivnost v primerjavi z izhodnimi 1,3,5-triazini. Vezavo spojine, ki je izkazovala encimsko aktivnost, smo ovrednotili z novejšo tehniko imenovano mikrotermoforeza (MST) in potrdili vezavo spojine na ATPazno domeno ter določili tudi konstanto vezave Kd. Stabilnost interakcijskega vzorca smo študirali s simulacijo molekulske dinamike (MD). Spojina iz tega razreda pa je močneje zavirala aktivnost razpletanja človeške topoizomeraze IIα (topoisomerase IIα-mediated decatenation) močneje kot znan zaviralec tega encima - zdravilna učinkovina etopozid. Za to spojino smo tudi pokazali, da ne stabilizira kovalentnega kompleksa, zato tudi ne deluje kot topoizomerazni strup. 1,3,5-triazin-2(1H)-oni predstavljajo tudi prve monociklične katalitične zaviralce z dokazano vezavo v vezavno mesto za ATP. Pridobljeni podatki predstavljeni v tej disertaciji predstavljajo odlično izhodišče za nadaljnji razvoj novih protirakavih zdravilnih učinkovin, ki so potrebne za zdravljenje naraščajočega števila rakavih obolenj.[B. Pogorelčnik]20152023-01-11 07:59:45Doktorsko delo/naloga143731UDK: 615.277.3(043.3)COBISS_ID: 279351040sl