Strukturno-podprto načrtovanje in vrednotenje spojin s potencialnim imunomodulatornim in nevroprotektivnim delovanjemBrus, Boris (Avtor) Gobec, Stanislav (Mentor) receptor TLR4bioaktivne spojineTollu podoben receptor 4proteasomvirtualno rešetanjezaviralci proteasomazaviralci imunoproteasomazdravljenje avtoimunih bolezniimunomodulatorne spojinedisertacijePomembnost računalniških metod v farmacevtski kemiji narašča, medtem ko je virtualno rešetanje postalo sestavni del procesa odkrivanja novih spojin zadetkov na različnih terapevtskih tarčah. Knjižnica spojin predstavlja izhodišče za izvedbo virtualnega rešetanja, njena kvaliteta pa je ključnega pomena za uspeh le-tega. V okviru doktorskega dela smo razvili postopen protokol, kjer smo s pomočjo različne programske opreme pripravili kvalitetne, filtrirane in obogatene knjižnice spojin, ki so nato predstavljale čvrsto osnovo za izvedbo sledečih virtualnih rešetanj na osnovi strukture tarče in na osnovi znanega liganda. Nove spojine zadetke smo s pomočjo metod virtualnega rešetanja iskali na terapevtsko pomembnih tarčah, kot so receptor TLR4 in encimi proteasom, imunoproteasom in butirilholin-esteraza. Receptor TLR4 v kompleksu s pomožnim proteinom MD-2 specifično veže komponento bakterijske celične stene po gramu negativnih bakterij (LPS), kar vodi v sproščanje vnetnih citokinov in aktivacijo imunskih celic, ki je ključnega pomena za obrambo pred infekcijami. Vendar pa prekomerna stimulacija receptorja TLR4 lahko vodi v pretiran odgovor imunskega sistema, kar povzroči poslabšanje stanja pri določenih patoloških procesih, zato receptor TLR4 predstavlja atraktivno tarčo za zdravljenje hude sepse in nevropatske bolečine. V procesu iskanja novih antagonistov receptorja TLR4 smo izvedli virtualno rešetanje na osnovi znanega derivata beta-amino alkoholov. Sočasno smo izvedli tudi strukturno-podprto virtualno rešetanje obogatene knjižnice spojin s ciljem motenja interakcije med proteinoma TLR4 in MD-2. Vzporedno virtualno rešetanje je vodilo v odkritje treh spojin z obetavnimi antagonističnimi aktivnostmi na receptorju TLR4 z vrednostmi IC50 v mikromolarnem območju. Te spojine imajo tudi imunomodulatorne lastnosti, saj zavirajo sproščanje citokinov iz človeških mononuklearnih celic periferne krvi. Specifično afiniteto najbolj aktivnega virtualnega zadetka (IC50 = 16,6 μM) do receptorja TLR4 smo potrdili tudi s poskusi direktne vezave s pomočjo površinske plazmonske resonance, zato odkritje te spojine predstavlja zelo obetavno izhodišče za razvoj novih antagonistov receptorja TLR4. Proteasom je multi-encimski kompleks, ki igra pomembno vlogo v nelizosomski razgradnji proteinov. Upoštevajoč strukturo aktivnega žepka in mesto izražanja razlikujemo konstitutivni, imuno- in timoproteasom. Zaviralci proteasomov izkazujejo pomembne protivnetne in protitumorne lastnosti, predvsem preko zaviranja aktivacije jedrnega dejavnika Nf-κB in spodbujanja apoptoze hitro delečih se celic. Na osnovi strukture znanega aminopiperidinskega liganda, ki preko zaviranja konstitutivnega proteasoma deluje selektivno toksično na celice Burkittovega limfoma, smo izvedli tridimenzionalno virtualno rešetanje z namenom odkritja ligandov z izboljšano aktivnostjo in drugačnim skeletom. Identificirali smo spojino s podobno razporeditvijo strukturnih elementov v prostoru, vendar drugačnim osnovnim skeletom, ki ima povečano selektivno toksičnost do celic Burkittovega limfoma, hkrati pa močneje zavira rast celic kot izhodna spojina (IC50 = 6,7 μM). Študije mehanizma delovanja nakazujejo tudi drugačen tarčni profil, ki ne vključuje zaviranja proteasoma ali signalne poti NFκB. Najnovejše študije so pokazale, da lahko specifično zaviranje imunoproteasoma predstavlja novo strategijo za zdravljenje avtoimunih bolezni, kot so revmatoidni artritis, vnetne bolezni črevesja in lupus. Nepeptidni in reverzibilni zaviralci imunoproteasoma so redki, zato smo izvedli virtualno rešetanje na osnovi razrešene kristalne strukture, kjer smo ciljali podenoto β5i. Odkrili smo derivat psoralena, ki specifično in selektivno zavira samo β5i podenoto imunoproteasoma (Ki = 15 μM), medtem ko zaviranja konstitutivnega proteasoma nismo zaznali. Preiskovanje odnosa med strukturo in delovanjem je vodilo v odkritje spojine 37, z izboljšanim delovanjem (Ki = 1,6 μM) in manjšo molekulsko maso. Študije sidranja psoralenskih derivatov so nakazovale smiselnost uvedbe elektrofilnih funkcionalnih skupin v bližino terminalne -COOH skupine, kar je omogočilo sintezo specifičnih kovalentnih zaviralcev imunoproteasoma z aktivnostjo v nanomolarnem območju. Odkriti derivati psoralena tako predstavljajo osnovo za intenzivno preučevanje vloge imunoproteasoma in za razvoj potencialnih novih imunomodulatornih spojin. Alzheimerjeva bolezen je napredujoča nevrodegenerativna motnja centralnega živčnega sistema, ki povzroči odmiranje nevronov in izgubo kognitivnih fukcij. Encim BChE je obetavna tarča za lajšanje simptomov Alzheimerjeve bolezni, saj se v poznih stadijih bolezni povečata tako ekspresija kot aktivnost samega encima. Z namenom odkritja novih reverzibilnih zaviralcev BChE smo razvili protokol za hierarhično virtualno rešetanje na osnovi strukture, s pomočjo katerega smo identificirali tri spojine, ki zaviranjo hidrolizno aktivnost BChE. Za najbolj aktivno spojino 1 (IC50 = 21,3 nM) smo razvili sintezno pot preko ortogonalno zaščitenih derivatov piperidin-3-ilmetanamina, nato pa smo s pomočjo kiralne HPLC resolucije pridobili še čista enantiomera spojine 1, od katerih evtomer (+)-1 izkazuje izrazito stereoselektivnost in 2,7 nM konstantno inhibicije. Razrešena kristalna struktura človeške BChE v kompleksu s spojino (+)-1 je razkrila način vezave in nam omogočila strukturno-podprto načrtovanje izboljšanih analogov na osnovi piperidina. Sulfonamidni derivat piperidina 4 ima izboljšano aktivnost (IC50 = 4,95 nM), manjšo stereoselektivnost obeh enantiomerov, razrešena kristalna struktura kompleksa BChE-zaviralec pa je razkrila tudi spremenjen način vezave v aktivno mesto encima. Spojina 4 izkazuje tudi pozitivne učinke na skopolaminskem modelu kognitivnega pomanjkanja in vivo. S spremembo metoksietilne verige spojine 1 smo v molekulo uvedli dodaten bazični center, ki je sposoben tvorbe kation-π interakcij v holin-vezavnem žepku. Spojina GUK942 je najbolj aktiven zaviralec v tej seriji s konstanto inhibicije v nizkem pikomolarnem območju. V okviru doktorskega dela smo optimizirali metodo za histološko barvanje po Koelleju, ki omogoča detekcijo aktivnosti holin-esteraz na možganskih rezinah. S pomočjo optimizirane metode po Koelleju smo v možganih našli specifična področja z visoko aktivnostjo BChE, na katerih smo dokazali zaviranje BChE s piperidinskimi derivati (spojini 1 in 4) ex vivo. Spojino 1 smo uporabili tudi za validacijo programa LiSiCA, ki išče 2D in 3D podobnost ligandov na osnovi iskanja maksimalnih klik. LiSiCA je izjemno učinkovito orodje, saj je omogočila odkritje petih novih zaviralcev BChE z aktivnostjo v nanomolarnem območju. Vsi zadetki vsebujejo drugačen skelet in manjšo molekulsko maso v primerjavi s spojino 1, kar nakazuje na uporabnost programa za t.i. ''scaffold-hopping''. Amiloidni plaki so glavna značilnost Alzeimerjeve bolezni, zvrsti amiloida beta pa povezujejo z nevrotoksičnostjo. Spojine, ki zavirajo spontano agregacijo amiloida beta, lahko delujejo nevroprotektivno in vplivajo na nastanek Alzheimerjeve bolezni. Odkrili smo, da novi zaviralci holin-esteraz, vplivajo tudi na spontano agregacijo amiloida beta do fibrilov. Spojina 1, ki je selektivni nanomolarni zaviralec BChE, izkazuje 61,7% zaviranje agregacije pri koncentraciji 10 μM, medtem ko spojina 13b kot selektivni nanomolarni zaviralec AChE pri tej koncentraciji izkazuje 66,0% zaviranje. Obe spojini delujeta tudi nevroprotektivno in zaščitita celice SH-SY5Y pred toksičnimi vplivi zvrsti amiloida beta. Upoštevajoč pomembno vlogo kovinskih ionov pri razvoju Alzheimerjeve bolezni, smo v piperidinske zaviralce BChE uvedli strukturne elemente, ki so sposobni kelacije dvovalentnih kovinskih ionov (Cu, Zn in Fe), pri tem pa smo ohranili zaviranje BChE in spontane agregacije amiloida beta. Spojina 8g je selektivni nanomolarni zaviralec BChE (IC50 = 215 nM), ki selektivno kompleksira Cu2+ ione in zavira spontano agregacijo amiloida beta do fibrilov pri koncentraciji 10 μM. Razrešena kristalna struktura 8g kompleksu s humano BChE je razkrila vezavo kelirajočega nitroksolinskega fragmenta v acil-vezavni žepek encima. Nitroksolinski derivati predstavljajo odlično izhodišče za nadaljnji razvoj multiplih ligandov za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni.[B. Brus]20152023-01-11 07:49:28Doktorska disertacija143730UDK: 615.4:54(043.3)COBISS_ID: 3841905sl