Vpliv estrogenov, oksidativnega stresa in hipoksije na epigenetske procese v osteoblastihVrtačnik, Peter (Avtor) Ostanek, Barbara (Mentor) estrogenioksidativni streshipoksijakostninahomeostazaregulatorjiosteoblastiepigenetikagensko izražanjehistonske acetilazehistonske deacetilazeDNA-metiltransferazemikroRNAdisertacijeEstrogeni, oksidativni stres in hipoksija so pomembni regulatorji kostne prenove in homeostaze. Poleg pomanjkanja estrogenov, ki so najpogosteje opisan patološki dejavnik, odgovoren za izgubo kostne mase in spremembe v mikroarhitekturi kostnine, ki vodijo v razvoj osteoporozo, postaja vedno bolj jasen tudi prispevek staranja in z njim povezanega oksidativnega stresa. Dobra vaskularizacija kostnega tkiva in s tem ustrezna preskrbljenost s kisikom prav tako igra pomembno vlogo pri normalnem razvoju skeleta in učinkoviti regeneraciji poškodb kostnine. Poleg omenjenih regulatorjev kostne homeostaze igrajo pomembno regulatorno vlogo v kosteh tudi epigenetski mehanizmi. Epigenetika je veda, ki proučuje stabilne in potencialno dedne spremembe v izražanju genov, za katere niso odgovorne spremembe v zaporedju DNA. Med najpomembnejše epigenetske mehanizme uvrščamo posttranslacijske spremembe histonov, posttranskripcijsko uravnavanje z mikroRNA in metilacijo DNA. Najbolj proučevana posttranslacijska sprememba histonov je acetilacija, za katero so odgovorne histonske acetilaze in deacetilaze. Medtem ko acetilacija histonov omogoči in spodbudi izražanje tarčnih genov, deacetilacija histonov transkripcijo zavre. Slednja pogosto predstavlja le prehodno inhibicijo izražanja tarčnih genov, ki pa lahko preide v bolj trajno obliko z metilacijo DNA. To nalogo opravljajo DNA-metiltransferaze, pri čemer pa je demetilacija lahko pasivna ali aktivna. Podobno kot deacetilacija histonov in metilacija DNA igrajo tudi mikroRNA predvsem inhibitorno regulatorno vlogo. Epigenetske spremembe so postale pomemben del raziskav številnih fizioloških in patoloških procesov tudi zato, ker lahko starost, mehanske obremenitve in okoljski dejavniki ravno preko njih vplivajo na izražanje tarčnih genov. Ker je povezava med znanimi regulatorji kostne homeostaze na eni strani in epigenetskimi procesi na drugi strani še vedno slabo raziskana, je bil namen doktorskega dela proučiti, kako estrogeni, oksidativni stres in hipoksija vplivajo na izražanje genov za histonske acetilaze, histonske deacetilaze, DNA-metiltransferaze in mikroRNA ter s tem na epigenetske procese v osteoblastih. V ta namen smo si najprej pripravili primerni eksperimentalni in vitro model, pri čemer smo uporabili osteosarkomsko celično linijo HOS, v katero smo vnesli kodirajoči del gena za estrogenski receptor α. Za proučevanje vpliva estrogenov smo uporabili 17β-estradiol, oksidativni stres smo izzvali z vodikovim peroksidom, hipoksijo pa z dodatkom mimetika hipoksije deferoksamina. Analizo izražanja genov, povezanih z epigenetskimi mehanizmi, smo izvedli dvostopenjsko. Na osnovi poznavanja epigenetskih mehanizmov in kostne biologije smo za presejalno testiranje izbrali 13 genov, ki kodirajo histonske acetilaze, 18 genov, ki kodirajo histonske deacetilaze, 9 genov, ki kodirajo DNA- metiltransferaze, in druge proteine, povezane z metilacijo DNA, 5 genov, značilnih za osteoblastno celično vrsto, in 3 hišne gene ter njihovo izražanje izmerili s pomočjo mrež, ki temeljijo na kvantitativni verižni reakciji s polimerazo v realnem času (qPCR). V potrditveni stopnji smo tiste gene, pri katerih smo zaznali spremembe v izražanju, analizirali še s posameznimi qPCR-testi na vzorcih večjega števila bioloških ponovitev. Rezultate, pridobljene na eksperimentalnem in vitro modelu, smo nato nadgradili in jim dodali poseben pomen z analizo izražanja najbolj obetavnih genov v obsežni zbirki kostnih vzorcev, pridobljenih od bolnikov z osteoporozo ali osteoartrozo, ter kontrol, brez znakov kostnih bolezni. Proučili smo tudi vpliv estrogenov, oksidativnega stresa in hipoksije na izražanje mikroRNA v osteoblastih, pri čemer smo uporabili zelo zmogljivo tehnologijo barvnih kod. V času razvoja in optimizacije našega eksperimentalnega in vitro modela smo se soočili z več izzivi, katerih pomen presega okvire naše študije. Tako smo ugotovili, da tripsinski reagent, pridobljen iz živalskega pankreasa, ki se sicer rutinsko uporablja pri presajanju adherentnih celic, vsebuje RNaze, ki vstopajo v celice z endocitozo in razgradijo njihovo RNA, ki je tako neprimerna za nadaljnje analize. Rešitev smo našli v neposredni lizi celic z reagentom, ki vsebuje fenol in gvanidin, tik pred samo izolacijo RNA ali v uporabi rekombinantnih tripsinskih nadomestkov, ki niso živalskega izvora. Prav tako se je izkazalo, da v osteosarkomski celični liniji HOS estrogenski receptor α ni prisoten niti na ravni mRNA niti na ravni proteinov. Najizraziteje se je izražal z G proteinom sklopljen estrogenski receptor 1, prisotno pa je bilo tudi šibko izražanje estrogenskega receptorja β. V našem eksperimentalnem in vitro modelu, z vnesenim estrogenskim receptorjem α, estrogeni niso vplivali na izražanje izbranih genov, povezanih z epigenetskimi mehanizmi. Izjema je bilo izražanje mikroRNA miR-338-3p. V skladu s tem estrogeni prav tako niso preprečili sprememb, ki sta jih v osteoblastih povzročila oksidativni stres in hipoksija. Oksidativni stres in hipoksija sta značilno vplivala na izražanje HDAC6, HDAC9, SIRT1 in MBD1, hipoksija pa še dodatno na izražanje HAT1, KAT5, HDAC7 in DNMT3A. Oksidativni stres in hipoksija sta prav tako značilno vplivala na izražanje miR-27, miR-34c, miR-133a, miR-148a, miR-155, miR-214-3p, miR-335, miR-503, miR-630 in miR-1246. Kljub temu, da sta imela zelo blag učinek na aktivnost signalne poti WNT/β-katenin, sta jo oba zavrla. Močnejši, vendar nasproten učinek sta imela tudi na sistem RANK/RANKL/OPG. Naši rezultati razkrivajo potencialno povezanost omenjenih signalnih poti z epigenetskimi mehanizmi v osteoblastih. Analiza izražanja genov, povezanih z epigenetskimi mehanizmi, v kostnih vzorcih je še dodatno potrdila izjemen pomen identificiranih genov v fiziologiji in patologiji kostnih celic. HAT1, KAT5, HDAC6, HDAC9, MBD1 in DNMT3A so tako novi kandidatni geni z zelo verjetno vlogo pri osteoporozi in osteoartrozi, na katere bi se morale osredotočiti prihodnje študije. Omenjeni geni prav tako predstavljajo potencialne tarče v osteoblastih, na katerih bi lahko temeljila prihodnja generacija zdravilnih učinkovin z anabolnim delovanjem na skelet.[P. Vrtačnik]20152023-01-11 07:32:20Doktorsko delo/naloga143726UDK: 577.21:611.018.4(043.3)COBISS_ID: 278090496sl