Izražanje in biokemijska karakterizacija vakuolnega procesivnega encima iz enocelične alge Chlamydomonas reinhardtiiArmič, Doroteja (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) legumainvakuolni procesivni encimChlamydomonas reinhardtiiCrVPEVakuolni procesivni encimi (VPE) so cisteinske proteaze, ki jih najdemo v rastlinah. Lokalizirani so v vakuolah, kjer cepijo peptidne vezi za asparaginskimi in aspartatnimi aminokislinskimi ostanki. VPE se sintetizirajo v obliki neaktivnih prekurzorjev, ki se avtokatalitsko procesirajo in aktivirajo pri kislem pH. Takšni pogoji so v vakuoli, kjer so VPE tudi aktivni. Po avtoaktivaciji lahko VPE opravljajo svojo funkcijo procesiranja drugih vakuolnih proteinov, ki se sintetizirajo v obliki neaktivnih prekurzorjev. Med drugim je VPE pomembna komponenta rastlinske programirane celične smrti, saj ima zaradi zmožnosti avtokatalitskega procesiranja in aktivacije prekurzorjev hidrolitičnih encimov funkcijo iniciatorja tega procesa. Cilj magistrskega dela je bil v celicah E. coli izraziti vakuolni procesivni encim iz alge Chlamydomonas reinhardtii (CrVPE) ter okarakterizirati njegovo avtokatalitsko procesiranje in aktivnost. Pričakovali smo, da se bo pri kislem pH (pod 5) CrVPE avtoaktiviral ter cepil peptidna substrata Ac-ESEN-AMC in Z-YVAD-AFC, kar je značilno za vakuolne procesivne encime. Pripravili smo pet konstruktov CrVPE. Protein CrVPE divjega tipa in njegov neaktivni mutant nam je uspelo izraziti v topni frakciji, vendar nam ju ni uspelo izolirati, saj sta se tekom izolacije razgradila. V celotni topni frakciji lizata celic E. coli po izražanju proteina CrVPE divjega tipa nismo izmerili relevantne aktivnosti na substrata Ac-ESEN-AMC in Z-YVAD-AFC; prav tako nismo opazili avtokataliskega procesiranja. Protein CrVPE, ki smo ga izrazili, torej ni bil aktiven. Poleg proteina CrVPE divjega tipa in njegovega neaktivnega mutanta smo pripravili še tri skrajšane variante proteina CrVPE, ki niso imele N- in/ali C-končne prodomene. Ugotovili smo, da se zrel protein CrVPE brez N- in C-končne prodomene ter protein CrVPE brez N-končne prodomene akumulirata v inkluzijskih telesih. Na podlagi tega predvidevamo, da je N-končna prodomena pomembna za pravilno zvitje proteina CrVPE in deluje kot šaperon.20232023-01-06 10:15:00Magistrsko delo/naloga143666VisID: 21861COBISS_ID: 138564355sl