Vrednotenje afinitete vezave represorja Tet na ciljno mesto DNA ob prisotnosti efektorja, podobnega transkripcijskemu aktivatorju (TALE) [A]Dragovan, Matej (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Leben, Katja (Komentor) TALEefektorji podobni transkripcijskim aktivatorjemTetRuravnavanje transkripcijeoptimizacija izolacijeafiniteta vezave.Efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (ang. transcription activator-like effectors, TALEs), so proteini, ki jih zaradi možnosti vezave na definirana vezavna mesta na polinukleotidni verigi na široko uporabljamo v sintezni biologiji. Sestavljajo jih številne kratke ponovitve aminokislinskih zaporedij (t.i. moduli oz. kanonične ponovitve iz 33 do 35 ostankov). Specifičnost TALE je mogoče urejati s spreminjanjem po dveh aminokislinskih ostankov v modulih, ki prepoznavajo in se vežejo na zaporedne nukleotide na eni od verig DNA. Poleg spajanja z efektorskimi domenami in urejanja DNA lahko vplivajo na nivo transkripcije, ki ga sproži drug transkripcijski dejavnik. S ciljem ovrednotiti afinetito vezave transkripcijskega dejavnika TetR ob hkratni vezavi proteina TALE [A] na DNA smo oba proteina izrazili v bakterijah Escherichia coli. Izolirali smo ju s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo in dodatno prečistili z gelsko filtracijo. Pri tem smo z namenom optimizacije čiščenja preizkusili več različnih kromatografskih pufrov. Z analitsko gelsko filtracijo, sklopljeno z večkotnim sipanjem laserske svetlobe (SEC-MALS) ter s tehnikama dinamičnega sipanja svetlobe in poliakrilamidne gelske elektroforeze v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata smo pokazali, da sta eksperimentalno določeni velikosti in molski masi primerljivi s teoretičnimi vrednostmi le teh in dokazali, da proteina med seboj ne interagirata. S testom zamika elektroforezne mobilnosti (ang. electrophoretic mobility shift assay, EMSA) smo določili disociacijsko konstanto TetR pri vezavi na DNA, medtem ko pri vezavi TALE [A] na DNA in vezavi TetR na DNA v prisotnosti TALE [A], nismo mogli določiti Kd zaradi nekonstantnosti vezave TALE [A] na DNA. Predpostavljamo, da so za to odgovorna različna konformacijska stanja rekombinantnega TALE [A].20222022-12-24 08:45:02Magistrsko delo/naloga143547VisID: 94911sl