Priprava porotvornih proteinov stiholizina I in II ter njunih mutant za vrednotenje z mikroskopijo na atomsko siloMajnik, Manca (Avtor) Lunder, Mojca (Mentor) García Linares, Sara (Komentor) stiholizinimutantinterakcija protein-lipidmikroskopija na atomsko silotvorba poreAktinoporini so skupina majhnih in bazičnih α-porotvornih toksinov, ki jih proizvajajo morske vetrnice. Kot vsi porotvorni proteini lahko tudi stiholizini obstajajo v dveh različnih konformacijah. Nastajajo kot topni monomeri, ki so v odsotnosti tarčnih membran stabilno zviti in vodotopni. Ko pridejo v bližino membrane tarčne celice, pride v njihovi strukturi do sprememb, ki vodijo v oligomerizacijo monomerov in do nastanka pore v membrani celice. To povzroči osmotski šok in neizogibno smrt tarčne celice. Stiholizina I in II (StnI in StnII) sta zelo podobna aktinoporina, ki ju proizvaja morska vetrnica Stichodactyla helianthus. Izkazujeta 93% homologijo zaporedja, a imata kljub temu različno hemolitično aktivnost. Ta razlika je posledica ionske interakcije, ki je prisotna v StnI, ne pa tudi v StnII, zaradi česar je odcepitev N-konca pri StnI otežena in hemolitična aktivnost nižja. Da bi to hipotezo podrobneje preučili, je skupina z Univerze Complutense v Madridu, Fakulteta za kemijske vede, Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo pripravila dvojni cisteinski mutanti StnI (StnI I7C/K68C) in II (StnII I6C/K67C). Ti mutanti sta sposobni tvorbe disulfidnega mostička znotraj svoje strukture, kar posnema ionsko interakcijo pri stiholizinu I in oteži oddaljitev α-vijačnice in tvorbo pore. Ti štirje proteini (StnI, StnII, StnI I7C/K68C in StnII, StnII I6C/K67C) so bili funkcionalno okarakterizirani, pri čemer je bilo ugotovljeno, da so se mutanti res vežeta na membrane, ki vsebujejo sfingomielin, vendar ne napredujeta do oblikovanja pore. Naše delo je bilo razdeljeno na tri dele. Prvi in glavni del je bil kloniranje vseh štirih genov, ki kodirajo beljakovine (StnI in StnII divjega tipa ter StnI I7C/K68C in StnII I6C/K67C) v izbrani plazmid, ki omogoča izražanje izražanje rekombinantnih proteinov s peptidnimi dodatki NPS3 tako na N- kot na C- koncu, le-ti pa omogočajo specifično kovalentno vezavo v vezavni sistem s peptidoma NPS2 in NPS4, ki se uporabljata v enomolekulski tehniki mikroskopije na atomsko silo. Drugi del je predstavljalo izražanje in čiščenje rekombinantnega StnII. Tako pripravljen rekombinantni protein se lahko uporablja v enomolekularni tehniki mikroskopije na atomsko silo, pri kateri je preiskovani protein razpet med premičnim elementom in površino. Predpostavlja se, da bo ta tehnika z eno molekulo posnemala mehanske sile, katerim so stiholizini podvrženi med molekularno transformacijo ki je potrebna za njihovo sestavo v transmembransko poro. Tretji del je bil test hemolize z vsemi štirimi proteini v odsotnosti in prisotnosti DTT, sredstva, ki reducira disulfidne vezi. V prisotnosti DTT so vse štiri beljakovine pokazale primerljivo hemolitično aktivnost, medtem ko sta v odsotnosti DTT le proteina divjega tipa pokazala vidno hemolizo.20222022-12-22 08:45:17Magistrsko delo/naloga143481VisID: 94877sl