Razvoj hitro odzivnega sistema na osnovi proteolize za izločanje proteinov iz endoplazemskega retikulumaPraznik, Arne (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) sintezna biologijasekrecija proteinovendoplazemski retikulumkonvencionalna pot izločanja proteinovposttranslacijske modifikacijeIzločanje topnih ter premikanje membranskih proteinov na površino celic je pomemben celični proces, s katerim celice nadzorujejo množico različnih funkcij, kot so medcelična signalizacija, hormonska regulacija, prenos signala med sinapsami, homeostaza, obramba pred patogeni idr. Nadzorovanje izločanja proteinov s sintezno-biološkimi sistemi se ponuja kot obetavno orodje za obvladanje različnih bioloških procesov ter za uporabo v terapevtske namene. Večina do sedaj razvitih sistemov za nadzorovanje izločanja proteinov iz sesalskih celic temelji na indukciji izražanja izločenih proteinov, ki nato potujejo do zunanjosti celice po konvencionalni sekretorni poti. Vendar sta za takšen pristop potrebni predhodna transkripcija in translacija proteina, ki šele nato začne vstopati v sekretorno pot, zaradi česar se začne protein kopičiti v biološko relevantnih količinah šele več ur po indukciji izražanja proteina. Za nekatere, zlasti terapevtske aplikacije, pri katerih je potreben odziv v nekaj minutah, ne urah, je takšen odziv prepočasen. V tem doktorskem delu smo razvili dva sistema – lumER in membER – za izločanje topnih in membranskih proteinov, pri čemer smo izločanje nadzorovali s pomočjo inducibilnih proteaz. V obeh sistemih se izločeni proteini predhodno izrazijo ter se zadržijo na konvencionalni sekretorni poti v endoplazemskem retikulumu s pomočjo kratkih C-končnih zadrževalnih aminokislinskih zaporedij. Odstranitev zadrževalnih zaporedij je pod nadzorom ortogonalnih virusnih proteaz iz družine Potyviridae, katerih aktivnost lahko reguliramo z malimi molekulami. Ker nadzor izločanja poteka na ravni posttranslacijskih modifikacij, sistema povsem zaobideta potrebo po sintezi in akumulaciji proteina po indukciji, zaradi česar sta hitrejša od primerljivih sistemov, ki temeljijo na indukciji izražanja izločenega proteina. Pokazali smo, da sta oba sistema med sabo ortogonalna ter da lahko pri obeh sistemih nadzorujemo izločanje s pomočjo ortogonalnih in inducibilnih virusnih proteaz. Sistema omogočata večkratno zaporedno induciranje izločanja. Nadalje smo pokazali, da lahko izločanje s sistemoma membER in lumER nadzorujemo s konstrukti za procesiranje vhodnih signalov po načelu dvovhodnih logičnih operacij. Na koncu smo sistema uporabili za nadzorovanje izločanja terapevtsko relevantnih proteinov. Ker sta zadrževanje ter izločanje zagotovljena z modularnimi elementi, je mogoče sistema povezati tudi z drugimi sinteznimi in naravnimi sistemi, ki temeljijo na proteolizi, prav tako pa sta sistema primerna za prenos na številne druge topne in membranske proteine, zaradi česar se ponujata kot močno orodje za številne potencialne aplikacije.20222022-12-09 07:15:02Doktorsko delo/naloga143230VisID: 23063COBISS_ID: 144182019sl