Ugotavljanje ter določanje virusov v naravno okuženih čebeljih družinah (Apis mellifera carnica) in razvoj okužbe v inokulirani čebelji zalegiŠimenc, Laura (Avtor) Toplak, Ivan (Mentor) molekularna biologijavirusne boleznidiagnostikagenetikačebelevirologijagenotipizacijasekvenciranje celotnega genomametodeverižna reakcija s polimerazoin vitro tehnikeV raziskavi smo ugotavljali in določali viruse v naravno okuženih čebeljih družinah (Apis mellifera carnica) in preučevali razvoj virusne okužbe v inokulirani čebelji zalegi. Razvili in uporabili smo nove začetne oligonukleotide, sondi TaqMan in standarda za kvantitativno metodo reverzne transkripcije in verižne reakcije s polimerazo v realnem času (RT-qPCR) za določitev in kvantifikacijo virusa Lake Sinai linije 3 (LSV3) in virusa mešičkaste zalege (SBV). Z metodo RT-qPCR smo pregledali 89 vzorcev klinično obolelih čebeljih družin, vzorčenih med aprilom 2016 in septembrom 2020, in 108 vzorcev klinično zdravih čebeljih družin, vzorčenih med oktobrom 2018 in oktobrom 2019, in ugotavljali, ali so prisotni čebelji virusi: virus akutne paralize čebel (ABPV), virus črnih matičnikov (BQCV), virus kronične paralize čebel (CBPV), virus deformiranih kril (DWV), LSV3 in SBV. Prisotnost ABPV smo ugotovili v 29,63 % klinično zdravih in 79,78 % klinično obolelih čebeljih družin, BQCV v 98,15 % klinično zdravih in 96,63 % klinično obolelih čebeljih družin. Prisotnosti CBPV nismo ugotovili v nobenem vzorcu klinično zdravih čebeljih družin, v klinično obolelih čebeljih družinah pa v 19,10 %. DWV smo ugotovili v 39,81 % zdravih in 69,66 % obolelih čebeljih družin, LSV3 pa v 67,59 % klinično zdravih in 48,31 % klinično obolelih čebeljih družin. Prisotnost SBV smo ugotovili v 35,19 % klinično zdravih in 22,47 % obolelih čebeljih družin. Statistično značilno višje število kopij smo ugotovili pri klinično obolelih čebeljih družinah, okuženih z ABPV, CBPV, DWV in SBV (p < 0,0001), medtem ko pri BQCV (p = 0,6597) in LSV3 (p = 0,0062) statistično značilnih razlik med zdravimi in obolelimi čebeljimi družinami nismo ugotovili. Iz devetih vzorcev klinično obolelih in desetih vzorcev klinično zdravih čebeljih družin, v katerih smo z določanjem nukleotidnega zaporedja po Sangerju predhodno ugotovili različne linije čebeljih virusov, smo z metodo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) določili 22 nukleotidnih zaporedij celotnih genomov čebeljih virusov, in sicer ABPV (n = 4), BQCV (n = 3), CBPV (n = 2), DWV (n = 5), LSV (n = 4), SBV (n = 1), Apis Rhabdovirus-1 ali ARV-1 (n = 1), Bee Macula-like virus ali BeeMLV (n = 1), Hubei partiti-like virus 34 ali HPLV34 (n = 1). Nukleotidna zaporedja genomov ABPV, BQCV, DWV in SBV so prva nukleotidna zaporedja celotnih genomov teh vrst virusov, identificiranih v Sloveniji. Nukleotidna zaporedja genomov ARV-1, BeeMLV in HPLV34 smo na območju Slovenije ugotovili prvič, zato odkritje predstavlja pomemben doprinos k ugotovljeni genetski raznovrstnosti čebeljih virusov pri nas in po svetu. Z namenom raziskovanja pomnoževanja čebeljih virusov in razvoja virusnih okužb pri ličinkah smo uporabili in vitro metodo gojenja čebeljih ličink. V razvojni fazi čebelje ličinke, od prvega do petega dneva starosti, smo z inokulacijo terenskih sevov LSV3 in SBV (per os) preučevali pomnoževanje virusov in umiranje ličink. Pomnoževanja LSV3 in SBV v ličinkah nismo ugotovili, prav tako nismo ugotovili značilnih razlik v umiranju ličink glede na različne odmerke virusa. Uvedene metode imajo velik potencial za nadaljnje študije virusnih, bakterijskih in drugih okužb pri čebelah.20222022-12-04 07:15:07Doktorsko delo/naloga142933VisID: 23057sl