Učinkovitost samoizrezujočega se označevalca CPD iz bakterije Vibrio choleraeBizjak, Ela (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) samoizrezujoči se označevalcicisteinska proteazna domenaCPDMARTXinozitol heksakisfosfatCisteinska proteazna domena (CPD) izhaja iz večfunkcijskega samoprocesirajočega toksina, ki vsebuje ponavljajoče motive (MATRX), iz bakterije Vibrio cholerae. Domena je odgovorna za virulentnost toksina, saj s cepitvijo na več mestih aktivira ostale domene, med njimi tudi domeno, ki kovalentno povezuje aktin in Rho-inaktivirajočo domeno. Za aktivacijo mora priti CPD v stik z inozitol heksakisfosfatom (IP6), ki je prisoten v citosolu evkariontskih celic. Ker CPD specifično cepi tudi na mestu, ki je del njenega aminokislinskega zaporedja, je primerna za uporabo kot samoizrezujoči se označevalec. Prednosti njene uporabe so: eliminacija potrebe po uporabi komercialno dostopnih proteaz, izvedba cepitve na koloni za nikljevo afinitetno kromatografijo in nizki stroški uporabe IP6. V diplomskem delu smo v bakteriji Escherichia coli seva BL21[DE3] izražali protein EGFP s C-končno fuzijo CPD s heksahistidinsko oznako. Z opravljenim poskusnim izražanjem smo določili, da zvijanje proteina ob indukciji z IPTG najbolje poteka pri 18 ⁰C. Izražanje smo ob takih pogojih izvajali tudi v večjem merilu. Rekombinantni protein smo preko heksahistidinske oznake izolirali, ga v prisotnosti različnih koncentracij IP6 aktivirali in opazovali, kako uspešno poteka samoizrezovanje. Cepitev smo spremljali v raztopini in preko vezave na aktivirane nikljeve kroglice. Potrdili smo, da prezgodnja aktivacija in nespecifične cepitve niso prisotne. Optimalne rezultate smo dosegli ob dvourni inkubaciji na aktiviranih nikljevih kroglicah s 500 μM IP6 pri 18 ⁰C. Za nadaljnjo karakterizacijo proteina smo po kromatografiji z ločevanjem po velikosti izvedli kristalizacijske preglede in dosegli kristalizacijo neaktivirane CPD v obliki proteina EGFP-CPD-His6.20222022-10-10 13:05:00Diplomsko delo/naloga141877VisID: 22159COBISS_ID: 132882691sl