Vpliv kavne kisline in železovih(iii) ionov ter njunih kompleksov na aktivnost katepsina BJanković, Milica (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) katepsin Bencimska inhibicijakavna kislinakovinski ionikinetične meritvekovinski kompleksZa pravilno delovanje živih organizmov je bistvenega pomena stroga regulacija encimske aktivnosti, saj nezadostno ali prekomerno delovanje encimov povezujemo z razvojem številnih patoloških stanj. Kot ena izmed za raziskave zanimivih skupin encimov se je izkazala skupina papainu podobnih proteaz in sicer so to cisteinski katepsini. Katepsin B je cisteinska peptidaza s katalitično diado sestavljeno iz cisteinskega in histidinskega ostanka. Izraža se v vseh tipih celic in večinoma nespecifično razgrajuje proteine in peptide. Njegova aktivnost je povezana z dolgim seznamom bolezni kot so nevrološka, avtoimunska, skeletna, kardiovaskularna obolenja ter nastanek in metastaziranje različnih malignih tumorjev. Zaradi tega so katepsini zelo priljubljena tema številnih raziskav na temo popolne ali delne inhibicije encimske aktivnosti. Kot inhibitorji aktivnosti katepsina B se dinamično preučujejo različne proteinske molekule, organske molekule, kovinski ioni in kovinski kompleksi. V okviru magistrske naloge smo preučevali inhibitorni vpliv kavne kisline v kombinaciji s kovinskimi ioni na aktivnost katepsina B. V prejšnjih raziskavah so sicer ugotovili inihbitorne učinke tako kavne kisline kot nekaterih kovinskih ionov na aktivnost katepsina B, vendar pa smo v tej študiji preverili vpliv kompleksov kavne kisline in izbranih kovinskih ionov na aktivnost encima ter ugotovili, ali ima kompleks močnejši inhibitorni učinek na aktivnost katepsina B kot posamezni komponenti. V začetnih poskusih sem preverila učinek kavne kisline v prisotnosti nekaterih kovinskih ionov, da bi določila, kateri ion najmočneje inhibira aktivnosti katepsina B v kombinaciji s kavno kislino. Kot najboljši so se izkazali železovi(III) ioni. Vpliv kavne kisline in železovih ionov na encimsko aktivnost pri treh različnih pH vrednostih sem spremljala s fluorometričnim zasledovanjem hidrolize sintetičnega substrata Z-FR-AMC, rezultate analizirala s programom GraphPad Prism in določila vrednosti konstant inhibicije in EC50 ter mehanizem delovanja in situ pripravljenega kompleksa. Ugotovili smo, da so inhibitorni učinki kavne kisline izboljšani, ko v reakcijske mešanice dodamo ustrezno količino železovih(III) ionov. Določene vrednosti EC50 za inhibicijo katepsina B z in situ pripravljenim kompleksom pri različnih pH so 6,9 ± 5,3 µM (pH 4,5), 7,1 ± 2,3 µM (pH 5,5), 24,9 ± 5,4 µM (pH 7,4) in so nižje v primerjavi z EC50 vrednostmi pri inhibiciji s posameznimi komponentami. Kompleks se je pokazal kot inhibitor encimske aktivnosti, ki deluje po mehanizmu linearne akompetitivne inhibicije s konstanto akompetitivne inhibicije Kiu= 4,27± 0,29 µM. Poskusila sem tudi sintetizirati in okarakterizirati kompleks kavne kisline in železovega(III) iona v množinskem razmerju 3:1, vendar je sinteza in posledično tudi karakterizacija kompleksa pokazala le delni uspeh. Problemi so bili bodisi v čistosti ali pa v topnosti nastalih produktov. Zagotovo pa je nadaljevanje raziskav v smeri sinteze kompleksa kavne kisline in kovinskih ionov in priprave kristalne strukture kompleksa smiselno, saj bi tako dobili boljši vpogled in bolj jedrnato razlago o načinu delovanja kompleksa kavne kisline in železovih ionov pri inhibiciji katepsina B.20222022-09-29 11:35:00Magistrsko delo/naloga141442VisID: 17861COBISS_ID: 132942851sl