Karakterizacija izbranih bicikličnih pirazolidinonov in hidroksipirazolov kot inhibitorjev dihidroorotat dehidrogenaze iz organizma Plasmodium falciparumMedved, Tadej (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) dihidroorotat dehidrogenazaPlasmodium falciparumhidroksipirazolibiciklični pirazolidinonikristalizacijaMalarija je še vedno ena izmed najbolj razširjenih nalezljivih bolezni na svetu, ki letno prizadene več kot 200 milijonov ljudi. Povzročajo jo protozoji iz rodu Plasmodium, izmed katerih je najbolj smrtonosna vrsta Plasmodium falciparum. Kljub širokem repertoarju protimalarijskih zdravil izkoreninjenje bolezni napreduje počasi, predvsem zaradi sprotnega pridobivanja odpornosti vrst Plasmodium proti uveljavljenim učinkovinam. Zaradi tega je nastala pobuda za sprotni razvoj novih, bolj učinkovitih in specifičnih zdravil, ki ciljajo različne tarče v plazmodijevem življenjskem ciklu. Med temi tarčami je encim dihidroorotat dehidrogenaza, ki v biosintezni poti pirimidinov katalizira pretvorbo L-dihidroorotata v orotat in je ključen za uspešno razmnoževanje plazmodijev. Z uporabo empiričnih metod in računalniškega načrtovanja so raziskovalci do zdaj sintetizirali že veliko selektivnih inhibitorjev tega encima z raznolikimi heterocikličnimi ogrodji. Tri novejše serije takih spojin so biciklični pirazolidinoni, 5-hidroksipirazoli in 3-hidroksipirazoli, katerih tarča je dihidroorotat dehidrogenaza iz vrste Plasmodium falciparum (PfDHODH). V magistrskem delu smo hoteli okarakterizirati zgornje tri serije spojin bodisi kinetično z encimskim testom bodisi strukturno s kokristalizacijo s tarčnim encimom. Obema skupinama hidroksipirazolov smo z uporabo kolorimetričnega encimskega testa želeli določiti moč inhibicije PfDHODH. Pokazali smo, da testirani hidroksipirazoli kvečjemu le šibko inhibirajo encim že pri sorazmerno visoki koncentraciji inhibitorja. Najboljšo inhibitorno aktivnost so pokazali 3-hidroksipirazoli, ki so močneje inhibirali encim kot etilmalonatni inhibitor, iz katerega so bili izpeljani. Biciklične pirazolidinone, katerih kinetični parametri so že znani, pa smo hoteli kokristalizirati v kompleksu s PfDHODH, da bi lahko pridobili strukturne podatke o vezavi teh spojin na encim. Izrazili smo rekombinantno, N-končno skrajšano obliko PfDHODH z dodatno delecijo strukturno neurejene zanke za izboljšano kristalizacijo. Protein smo očistili v treh stopnjah, pripravili komplekse s tremi bicikličnimi pirazolidinoni in jih poskusili kokristalizirati iz sedečih kapljic. Nepričakovano je dodatek teh spojin povzročil agregacijo rekombinantnega PfDHODH, kar je vplivalo na rezultat kristalizacije. Dobili smo en kristal kompleksa z enim od testiranih bicikličnih pirazolidinonov, a kristal ni bil dovolj kvaliteten za difrakcijsko analizo, je pa dal informacijo o ugodnem pogoju za tvorbo kristalov.20222022-09-21 07:40:00Magistrsko delo/naloga140893VisID: 22125COBISS_ID: 131905283sl