Kloniranje in izražanje proteina TDP-43 in njegovih mutantov v bakterijskih celicahSernc, Maruša (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) TDP-43amiotrofična lateralna sklerozamutantiizražanje proteinaizolacija proteinaTAR DNA vezavni protein oz. TDP-43 je 414 aminokislin dolg predstavnik družine heterogenih jedrnih ribonukleoproteinov (hnRNP). Sestavljen je iz urejene N-končne domene, ki je ključna za tvorbo homodimerne oblike, v kateri se protein, v fizioloških pogojih, največkrat nahaja. Nato sledi zanka, ki predstavlja jedrni lokalizacijski signal, tej pa dve RNA-prepoznavni domeni RRM1 in RRM2. Konec proteinske strukture predstavlja neurejena C-končna domena, ki je običajno podvržena številnim mutacijam. Protein TDP-43 se pretežno nahaja v jedru, kjer sodeluje v vseh stopnjah procesiranja in regulacije RNA, kontrolira izražanje genov in nekodirajočih RNA, omogoča stabilnost in transport mRNA, hkrati pa posreduje tudi pri tvorbi stresnih granul, kjer se mRNA z vezavnimi proteini poveže v majhne, agregirane citoplazemske strukture. Slednje nastanejo kot odgovor evkariontskih celic na stres iz okolja, katere se na ta način lahko osredotočijo le na sintezo proteinov, ključnih za preživetje celice. Kopičenje TDP-34 v citoplazmi je značilno za patološko stanje nevronov, kar vodi v celično smrt in je značilno za nekatere nevrodegenerativne bolezni, med katere sodi amiotrofična lateralna skleroza (ALS). V diplomskem delu smo poskušali izolirati divji tip proteina TDP-43 in štiri njegove mutante. Po metodi IVA kloniranja smo pripravili rekombinantni vektor pMCSG7, v katerega smo vstavili zapis za TDP-43 skupaj z zapisom za maltoza vezavni protein (MBP). Slednji se je v prvem primeru nahajal na N-koncu zapisa za TDP-43, v drugem primeru pa na C-koncu. Po izražanju v prokariontskih celicah E. coli seva BL21[DE3], smo fuzijski protein izolirali s pomočjo nikljeve afinitetne kromatografije in ga nato očistili na heparinski koloni. Ugotovili smo, da je stabilna le fuzija z MBP na C-koncu, fuzijski protein z MBP na N-koncu je fragmentiral med oz. po izolaciji. Pripravili smo dovolj velike količine proteina TDP-43-MBP za nadaljnje agregacijske in interakcijske študije. Od mutiranih oblik smo izolirali TDP-43 z oznako 301/307, ki vsebuje le obe regiji RRM, MBP pa ima, enako kot divji tip, na C-koncu. V nadaljnjem delu bi bilo smiselno optimizirati postopek izolacije mutiranih oblik proteina in izvesti agregacisjke in interakcijske študije TDP-43 in njegovih mutantov, ki so relevantni za nevrodegenerativne bolezni.20222022-09-09 14:40:00Diplomsko delo/naloga140028VisID: 22157COBISS_ID: 129809667sl