Kloniranje in izražanje proteina NONO v bakterijskih celicah Escherichia coliBeltram, Ajda (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) NONOamiotrofična lateralna sklerozaparapegeizražanje in izolacija proteinaAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene predvsem motorične nevrone in povzroči njihovo degradacijo. Odkrili so 20 genov, katerih mutacije naj bi bile povezane z nastankom ALS. Najbolj pogosta mutacija je v genu C9ORF72 (odprti bralni okvir 72 kromosoma 9), kjer pride do povečanja intronskih ponovitev GGGGCC (G4C2)n, kar med drugim povzroči sekvestracijo nekaterih RNA-vezavnih proteinov. Nekatere mutacije pa so v genih, ki zapisujejo proteine parapeg in povzročijo njihovo premestitev iz jedra v citoplazmo, kar vpliva na funkcije parapeg. Parapege so jedrna ribonukleoproteinska telesca brez membrane, sestavljena iz nekodirajoče RNA NEAT1 (jedrni prepis 1 združka parapege) in nanjo vezanih proteinov, izmed katerih sta ključna proteina NONO (oktamer vezavni protein brez domene POU) in SFPQ (spojitveni faktor, bogat s prolini in glutamini). Posledica mutacij, povezanih z ALS, je tudi spremenjeno delovanje proteina NONO, to je RNA- in DNA- vezavni protein, ki spada v družino proteinov DBHS (proteini vedenja Drosophile in človeški spojitveni). Ugotovili so, da se skupaj s proteinom SFPQ veže na prepise ponovitev (G4C2)n, pri čemer nastanejo parapegam podobna telesca, ki so morda eden od patoloških mehanizmov ALS. Da bi lahko preučili interakcije znotraj parapegam podobnih telesc, smo poskusili izraziti protein NONO v fuziji s proteinom, ki veže maltozo (MBP). Pripravili smo dva konstrukta tako, da smo zapis za NONO vstavili v vektor pMCSG7 z zapisom za MBP na N- oziroma C- koncu. Pri izražanju obeh variant v celicah E. coli BL21[DE3] smo fuzijska proteina najprej izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo, pri čemer smo bili v obeh primerih uspešni, a smo varianto z MBP na N-koncu izolirali v večji količini. Poleg tega smo oba fuzijska proteina poskusili izolirati s kolono z afiniteto do MBP, vendar je bil izkoristek manjši kot pri izolaciji z nikljevo afinitetno kromatografijo. Da bi izolirali le protein NONO, smo fuzijskemu proteinu z MBP na N-koncu odcepili oznako His-MBP s proteazo TEV in ga nato očistili s kromatografijo z ločevanjem po velikosti, a smo pri tem imeli velike izgube. Poleg tega pa smo ugotovili, da nobeden od fuzijskih proteinov ni stabilen pri 4 °C, saj sta oba fuzijska proteina agregirala oziroma se razgradila. Izolacijo proteina NONO moramo optimizirati, da bomo dobili ustrezne količine proteina za analizo interakcij v parapegah podobnih telescih.20222022-09-06 13:05:00Diplomsko delo/naloga139700VisID: 22162COBISS_ID: 126611971sl