Priprava flourescenčno označenih efektorskih proteinov VnaSSP4.2 in Vna7.443 z namenom razumevanja njihove funkcijeBole, Martin (Avtor) Berne, Sabina (Mentor) Volk, Helena (Komentor) hmeljfitopatogena glivaVerticillium nonalfalfaeefektorheterologna ekspresijaVna7.443VnaSSP4.2MORN 1tandemske ponovitveNavadni hmelj (Humulus lupulus L.) je dvodomna trajna dvokaličnica, ki pripada družini konopljevk. Njegov primarni škodljivec je fitopatogena gliva Verticillium nonalfalfae. Ločujemo blago in letalno obliko verticilijske uvelosti, ki vsako leto lahko uniči od 10 do 50 % vsega pridelka. Patogen z namenom kolonizacije rastlinskega gostitelja in preskrbe glive s hranili izloča efektorje, s katerimi vpliva na celično fiziologijo gostitelja (transkripcija, signalizacija, epigenetska regulacija, sinteza in izločanje proteinov), ali modulira njegov imunski odgovor (sinteza sekundarnih metabolitov, signalizacija). Poznavanje strukture, mehanizma translokacije in biološke funkcije glivnih efektorjev je ključno za razumevanje mehanizmov patogenosti glive in oblikovanje strategij za trajno zaščito pridelka v Sloveniji in po svetu. Cilj magistrske naloge je bil pridobiti očiščena, fluorescenčno označena proteina VnaSSP4.2 in Vna7.443 ter ju uporabiti v bioloških in biokemijskih testih z namenom razumevanja njune funkcije. S kloniranjem In-Fusion smo uspešno pripravili konstrukte Vna7.443::DsRed2, DsRed2::Vna7.443 ter reporter DsRed2, jih izrazili v E. coli ter proteine očistili in stabilizirali. Prav tako smo v E. coli izrazili konstrukt eGFP::VnaSSP4.2 in rekombinantni protein očistili. Rekombinantni fluorescenčni protein eGFP::VnaSSP4.2 v listih modelne rastline N. benthamiana povzroči kloroze in se v plazmalemi specifično lokalizira v membranskih mikrodomenah. Rekombinantni fluorescenčni protein DsRed2::Vna7.443 s prostim C- terminalnim koncem morda interagira z genomsko DNA gostiteljske rastline H. lupulus L. Protein Vna7.443 je strukturno podoben proteinom, ki vsebujejo MORN ponovitve. Potencialne vezave Vna7.443 na DNA in vivo, po nastanku por, ki jih oblikuje VnaSSP4.2, nismo preverili, smo pa delno potrdili hipotezo, da bi tak mehanizem lahko obstajal.20222022-08-31 07:16:32Magistrsko delo/naloga139106VisID: 208221COBISS_ID: 119806723sl