Povezave med strukturo in funkcijo metakaspaz CrMCA-I in CrMCA-II iz alge Chlamydomonas reinhardtiiVogrinec, Lana (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) cisteinske proteazemetakaspazeChlamydomonas reinhardtiiCrMCA-ICrMCA-IIMetakaspaze so cisteinske proteaze, ki se na osnovi strukturne homologije s kaspazami uvrščajo v družino C14 klana CD. Najdemo jih pri raznovrstnih organizmih, med drugim pri bakterijah, arhejah, algah, enoceličnih evkariontih in rastlinah, ne pa tudi pri živalih. Poleg kaspazam homolognih domen p20 in p10 lahko vsebujejo tudi nekatere dodatne regije, glede na katere se delijo na tri tipe: tip I, tip II in tip III. Metakaspaze se od kaspaz razlikujejo v specifičnosti, saj za razliko od slednjih cepijo substrate z bazičnimi aminokislinskimi ostanki na mestu P1. Poleg tega metakaspaze za razliko od kaspaz za aktivacijo večinoma potrebujejo Ca2+, nekatere pa so podvržene tudi specifičnim cepitvam. Te so še posebej značilne za metakaspaze tipa II, kjer je avtoprocesiranje za ohranjenim bazičnim aminokislinskim ostankom v povezovalni regiji ključno za aktivacijo. Namen magistrske naloge je bil raziskati povezavo med značilnimi strukturnimi elementi metakaspaz in njihovo vlogo pri aktivnosti oziroma aktivaciji. Bioinformacijsko smo analizirali ohranjenost posameznih aminokislinskih ostankov znotraj različnih tipov metakaspaz. Na osnovi teh analiz smo izbrali aminokislinske ostanke, ki bi lahko bili pomembni za specifične lastnosti metakaspaz CrMCA-I in CrMCA-II iz alge Chlamydomonas reinhardtii. Pripravili smo nukleotidna zaporedja z uvedenimi točkovnimi mutacijami, pri čemer smo v zapisu za CrMCA-I mutirali ostanke, povezane s specifičnostjo in aktivacijo, pri CrMCA-II pa z avtoprocesiranjem. Izolirali smo skrajšan rekombinantni protein CrMCA-I ter njegove mutante. Primerjali smo aktivnost izoliranih proteinov na proteinske in peptidne substrate ter določili kinetične parametre za cepitev izbranih sintetičnih substratov. Ugotovili smo, da so vsi mutanti sposobni cepitve večjih proteinskih substratov, medtem ko so v primerjavi z izhodiščnim encimom slabše aktivni na sintetične metakaspazne substrate. Prav tako noben od mutantov ni sposoben cepiti kaspaznih substratov. Poleg tega smo uspešno izolirali tudi protein CrMCA-II, ne pa tudi njegovih mutantov. Analizirali smo stopnjo avtoprocesiranja CrMCA-II pri različnih temperaturah in koncentracijah Ca2+. Dokazali smo, da se v prisotnosti Ca2+ divji tip CrMCA-II takoj razcepi na dva fragmenta, kar je opazno že pri 4 °C. Pri temperaturi nad 18 °C in 10-minutni inkubaciji pride do dodatnih cepitev, sčasoma pa se encim popolnoma razgradi.20222022-08-29 08:15:10Magistrsko delo/naloga139002VisID: 15681COBISS_ID: 121487363sl