Kloniranje mutiranih različic antitoksina 1067 iz cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806.Nemanič, Vivian (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) Microcystis aeruginosa PCC 7806antitoksintoksinMaOCA-IaSistemi toksin-antitoksin (TA) so genetski elementi, ki so sestavljeni iz zapisa za toksin in za kompatibilen antitoksin ter so pogosto prisotni pri bakterijah in arhejah. Sestavljeni so iz toksina, ki inhibira rast celic, ter iz antitoksina, ki onemogoča delovanje toksina. Najbolj pogosti in najbolje okarakterizirani sistemi TA so sistemi tipa II, pri katerih sta toksin in antitoksin proteina in skupaj tvorita tesen kompleks. Microcystis aeruginosa je cianobakterija, ki naseljuje raznolike ekološke niše in v okolju zelo dobro uspeva. To ji omogočajo različni genetski elementi, med katere spadajo tudi sistemi toksin-antitoksin. En par sistema TA tipa II v M. aeruginosa je zanimiv zato, ker je v genomu M. aeruginosa seva PCC 7806 v neposredni bližini gena, ki zapisuje za eno izmed šestih ortokaspaz, ki so prisotne pri tem sevu, MaOCA-Ia (prej MaOC1). Domnevni par TA je sestavljen iz toksina, ki je podoben toksinom družine RelE/ParE, ter iz sorodnega antitoksina. MaOCA-Ia je proteolizno aktivna proteaza, ki preferenčno cepi za skupki bazičnih aminokislinskih ostankov. Takšna zaporedja najdemo tudi pri antitoksinu 1067, in sicer sta v aminokislinskem zaporedju dve regiji, ki vsebujeta skupke dveh oziroma treh argininov. V sklopu te diplomske naloge nas je zanimalo, ali MaOCA-Ia cepi antitoksin 1067 za omenjenima dvema regijama v aminokislinskem zaporedju. Ker tega predhodno ni bilo mogoče ugotoviti s protitelesi proti oznaki His6, smo cepitev poskušali dokazati tako, da smo pripravili mutirane antitoksine na ravni DNA. Predhodno je bilo torej potrebno divjemu tipu antitoksina 1067 spremeniti zaporedje, kar smo naredili tako, da smo obe omenjeni regiji mutirali. Po indukciji izražanja smo pridobili mutirane antitoksine, ki so nam omogočili analizo cepitvenih mest. V sklopu tega diplomskega dela smo pripravili zapise za tri mutirane različice antitoksina 1067 z inverzno verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Pravilnost zaporedij z uvedenimi mutacijami smo preverili s sekvenciranjem in kasneje z bioinformacijsko analizo zapisov.20222022-08-26 10:30:00Diplomsko delo/naloga138966VisID: 20301COBISS_ID: 120808451sl