Priprava proteina CRISP iz modrasovega strupa v bakterijskem ekspresijskem sistemuMarinko, Aljoša (Avtor) Križaj, Igor (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) kačji strupVipera ammodytes ammodytesCRISPrekombinantni VaaCRISP-1E. coliS cisteinom bogati sekretorni proteini (CRISP) so razširjeni po celotnem živalskem kraljestvu, kjer vršijo različne funkcije. So monomerni proteini z molekulsko maso od 20 do 30 kDa. Večina CRISP iz kačjih strupov je inhibitorjev ionskih kanalčkov, natančneje kalcijevih kanalčkov odvisnih od napetosti, kalijevih kanalčkov aktiviranih s kalcijem in ionskih kanalčkov aktiviranih s cikličnimi nukleotidi. Biološka funkcija CRISP iz strupa modrasa (Vipera ammodytes ammodytes, Vaa) še ni znana. Za boljše razumevanje njihove aktivnosti smo poskušali pripraviti rekombinantni VaaCRISP-1 (rVaaCRISP-1). Nukleotidno zaporedje VaaCRISP-1 je bilo vstavljeno v vektor pMAL‑c5x, ki je bil pozneje vnešen v sev bakterije Escherichia coli (E. coli) ER2523. Fuzijski protein je imel na svojem N-koncu protein, ki veže maltozo (MBP), sledil je del s cepitvenim mestom za aktivirano obliko faktorja X (FXa), nato pa rVaaCRISP‑1. MBP je omogočil lažjo izolacijo produkta iz reakcijske zmesi z afinitetno kromatografijo na imobilizirani amilozi. Izražanje fuzijskega proteina v manjšem, do četrtlitrskem obsegu je bilo uspešno, v večjem, dvolitrskem, pa ne. Medtem, ko je v prvem primeru analiza frakcije, ki se je zadržala na amilozni koloni, pokazala prisotnost fuzijskega proteina, je bil v drugem prisoten zgolj MBP. Po cepitvi fuzijskega proteina s FXa smo rVaaCRISP-1 očistili na koloni C18 sistema RP-HPLC. Glede na pridobljene strukturne karakteristike, maso in hidrofobnost, o čemer priča RP-HPLC profil, ki je enak profilu naravnega proteina, lahko s precejšnjo gotovostjo trdimo, da sta si rekombinantni in naravni VaaCRISP-1 po lastnostih enaka. Ocenjen donos izražanja v bakterijski kulturi je ~0,1 mg rVaaCRISP‑1 na liter tekočega gojišča, medtem ko imajo lahko optimizirani postopki proizvodnje rekombinantnih proteinov v citoplazmi E. coli pričakovan donos tudi nad 100 mg tarčnega proteina na liter tekočega gojišča. Razvili smo torej postopek za pripravo pravilno zvitega rVaaCRISP-1, a njegov donos bo potrebno še izboljšati.20222022-07-08 14:10:00Magistrsko delo/naloga138065VisID: 10541COBISS_ID: 117051651sl