Izražanje in aktivacija proteaze CEP2 iz zelene alge Chlamydomonas reinhardtii v bakterijskih celicah Escherichia coliBožič, Tinkara (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) Chlamydomonas reinhardtiipapainu podobne cisteinske proteazerastlinska celična smrtCEP2izražanje in čiščenje proteinovCisteinska endopeptidaza CEP2 iz zelene alge Chlamydomonas reinhardtii sodi v družino papainu podobnih cisteinskih proteaz (angl. papain like cysteine proteases, PLCP). Predstavniki družine PLCP so v rastlinah povezani z regulirano celično smrtjo, ki ji v fizioloških pogojih (npr. razvoj rastline) lahko rečemo tudi programirana celična smrt (angl. programmed cell death, PCD). Med PLCP so pomembne proteaze RD21 iz modelne rastline Arabidopsis thaliana, ki sodelujejo pri sprožitvi PCD pri rastlinah in njihovemu imunskemu odgovoru proti patogenom. Cisteinska endopeptidaza CEP2 iz C. reinhardtii je sorodna predstavnikom iz poddružine RD21B, zato ima morda podobno vlogo v rastlinski celični smrti. Da bi lažje predvideli biokemijske lastnosti CEP2, smo proteazo najprej bioinformacijsko analizirali. Na podlagi aminokislinskega zaporedja proteina CEP2 smo s spletnimi orodji pripravili model njegove terciarne strukture. Aminokislinsko zaporedje CEP2 smo tudi primerjali z zaporedjem RD21B in iz poravnave obeh predvideli vlogo posameznih delov zaporedja in obseg določenih domen v polipeptidni verigi. Laboratorijsko delo smo začeli s pripravo rekombinantnega proteina CEP2 v bakterijskih celicah Escherichia coli, seva Rosetta-gami 2. Temu je sledila izolacija proteina, preučevali pa smo tudi aktivacijo proteina CEP2 zaradi znižanja pH. Opazili smo, da se protein delno procesira že med izražanjem in izolacijo, saj se mu odcepi C-končna domena, ter da je očiščen protein približno enako aktiven tako brez predhodne inkubacije v pufru z znižanim pH kot po njej. Poleg tega smo pripravili tudi pH-profil aktivnosti encima in pokazali, da je CEP2 optimalno aktiven v rahlo kislem območju, pri pH 5,0. Na podlagi rezultatov poskusa, s katerim smo zavrli avtokatalitično delovanje encima, sklepamo, da se protein CEP2 ne avtoprocesira, ampak je za cepitev proteina zaslužna neka proteaza, ki je prisotna v lizatu E. coli, a še ni identificirana.20222022-07-08 10:10:00Diplomsko delo/naloga138056VisID: 22072COBISS_ID: 117152771sl