Priprava plazmida za izražanje fuzijskega proteina sestavljenega iz GFP in proteaze iz Vibrio choleraeBabnik, Ana (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) domena cisteinske proteazezeleni fluorescenčni proteinkloniranje s sestavljanjem in vivorekombinantni proteinDomena cisteinske proteaze (CPD) je del večfunkcijskega samoprocesirajočega toksina, ki vsebujejo ponavljajoče motive (MARTX) iz Vibrio cholerae. Pri vstopu MARTX toksina v citosol evkariontske celice se zaradi prisotnosti InsP6 aktivira CPD. Ta ima avtoproteolitično aktivnost, saj cepi toksin na samostojne domene, ki povzročijo kovalentno povezovanje aktina, kar vodi v depolarizacijo aktinskega citoskeleta. V diplomskem delu smo z metodo kloniranja s sestavljanjem in vivo pripravili plazmid z zapisom za rekombinantni protein, sestavljen iz GFP, CPD in heksahistidinske oznake. Bakterije Escherichia coli DH5α smo transformirali z vektorjem pET22b, ki je vseboval zapis za naš fuzijski protein. Z metodo PCR na osnovi ene kolonije smo preverili, katere kolonije so ustrezne za izolacijo plazmidne DNA. Nukleotidno zaporedje plazmida je bilo določeno z metodo po Sangerju in potrjeno s poravnavo zaporedij.20222022-07-06 09:25:00Diplomsko delo/naloga137932VisID: 17262COBISS_ID: 116811523sl