Delovanje ortokaspaze MaOC1 na par toksin-antitoksin Ipf_1067/1065 cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806Halužan Vasle, Ana (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) sistemi toksin-antitoksinortokaspazaMicrocystis aeruginosaSistemi toksin-antitoksin so genetski moduli na kromosomih in/ali plazmidih številnih bakterij in arhej. Zapisujejo stabilen toksin in kratkoživ antitoksin. Sprva so veljali zgolj za dejavnike stabilizacije plazmidov s postsegregacijskim ubijanjem, z nadaljnjimi raziskavami pa se je izkazalo, da sodelujejo tudi v drugih celičnih procesih, kot sta preživetje neugodnih življenjskih razmer in tvorba persistentnih celic. Izraženi toksini vplivajo na celične procese in porušijo običajno delovanje biokemijskih poti, kar onemogoči nadaljnjo rast celice. Te učinke lahko prepreči antitoksin, ki nasprotuje delovanju toksina. Analiza genoma cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 je razkrila prisotnost šestih zapisov za ortokaspaze. To so prokariontski homologi kaspaz, ki verjetno delujejo kot regulatorji programirane celične smrti. V okolici zapisa za ortokaspazo MaOC1 sta tudi zapisa za dva para toksin-antitoksin – Ipf_1067 in Ipf_1065 ter Ipf_1064 in Ipf_1063. Oba para sta proteinska, pri čemer par Ipf_1067/1065 uvrščamo v tip RelBE, par Ipf_1064/ 1063 pa v tip VapBC. V magistrski nalogi smo želeli raziskati vpliv ortokaspaze MaOC1 na par toksin-antitoksin Ipf_1067/1065 cianobakterije Microcytis aeruginosa PCC 7806 v bakteriji Escherichia coli. Z bioinformacijskimi orodji smo pripravili teoretična strukturna modela toksina Ipf_1065 in antitoksina Ipf_1067. Primerjali smo ju s strukturama toksinov RelE in ParE ter antitoksinov RelB in ParD. Z namenom določitve kristalne strukture kompleksa smo na podlagi izsledkov bioinformacijske analize predvideli mesta mutacij, ki bi zmanjšale toksičnost toksina Ipf_1065, a hkrati ohranile možnost povezovanja z antitoksinom Ipf_1067 v kompleks toksin-antitoksin. Pripravili smo plazmide, ki so nosili zapise za ortokaspazo MaOC1, toksin Ipf_1065, antitoksin Ipf_1067 in par Ipf_1067/1065 v različnih kombinacijah. Plazmidi so omogočali izražanje omenjenih komponent v bakteriji Escherichia coli. Da bi določili način delovanja MaOC1 na par Ipf_1067/1065, smo z merjenjem OD600 v različnih časovnih intervalih spremljali rast bakterijskih kultur Escherichia coli BL21(DE3), transformiranih z ustreznimi plazmidi. Ugotovili smo, da izražanje toksina Ipf_1065 upočasni rast celic Escherichia coli, izražanje para Ipf_1067/1065 pa na hitrost rasti ne vpliva. Rast celic, ki so konstitutivno izražale MaOC, se je po začetku izražanja para Ipf_1067/1065 močno upočasnila. Predvidevamo, da je ortokaspaza cepila nastajajoč antitoksin, ki nato ni mogel nevtralizirati nastajajočega toksina in tako preprečiti njegovih učinkov na celice. Rezultati magistrske naloge so osvetlili delovanje ortokaspaze MaOC1 na par toksin-antitoksin Ipf_1067/1065.20222022-06-17 14:40:08Magistrsko delo/naloga137462VisID: 8021COBISS_ID: 115499267sl