Načrtovanje, sinteza in vrednotenje potencialnih učinkovin za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni z multiplim mehanizmom delovanjaKnez, Damijan (Avtor) Gobec, Stanislav (Mentor) nevrodegenerativne boleznizdravilazaviralci holin-esterazzdravilne učinkovinenačrtovanjesintezavrednotenjeAlzheimerjeva bolezen zdravljenjeučinkovine z večvrstnim delovanjemNevrodegenerativna obolenja zaradi staranja prebivalstva in posledično večjega števila bolnikov predstavljajo pereč zdravstveni problem. Med najbolj prepoznanimi je Alzheimerjeva bolezen, napredujoča motnja centralnega živčnega sistema, ki vodi v propad predelov možganov, posledično izgubo spomina ter motenj ostalih kognitivnih sposobnosti. Točen mehanizem nastanka in poteka bolezni še vedno ni pojasnjen, znano pa je, da do klinične slike vodi več patoloških procesov na molekularnem in celičnem nivoju. Izrazite poškodbe holinergičnega sistema in upad koncentracije živčnega prenašalca acetil holina privedejo do tipičnih motenj v spominu, ki se lajšajo z zaviralci holin esteraz. Encim butirilholin esteraza (BChE) opravlja v nekaterih predelih možganov podporno vlogo pri zaključevanju holinergičnega prenosa, z napredovanjem bolezni pa lahko ta vloga celo prevlada, saj encim opravi glavnino hidrolazne aktivnosti. Zaradi povečane aktivnosti in izražanja v poznih stadijih boleznih predstavlja BChE pomembno tarčo za lajšanje simptomov v teh stopnjah Alzheimerjeve bolezni. Poleg opisanega igrajo pri razvoju bolezni pomembno vlogo tudi številni drugi procesi. Nastanek in agregacija amiloida beta do amiloidnih plakov je ena od najbolj izrazitih patoloških sprememb, opaženih pri bolnikih. Različne zvrsti amiloida beta povezujejo z nevrotoksičnostjo, h kateri pa pomembno prispevajo tudi povečan oksidativni stres in motnje v porazdelitvi biološko pomembnih dvovalentnih kovinskih ionov. Trenutna simptomatska terapija Alzheimerjeve bolezni nima velikega vpliva na potek bolezni. Za učinkovito zdravljenje in izboljšanje simptomov bi bilo zato potrebno delovati na več tarč hkrati. Razvoj potencialnih učinkovin, ki bi lahko vzročno vplivale na nastanek in potek bolezni, se je tako usmeril v načrtovanje učinkovin z multiplim mehanizmom delovanja (multifunkcionalne spojine). Selektiven zaviralec BChE 1 (IC50 = 21,3 nM), ki je bil rezultat uspešnega strukturno podprtega virtualnega rešetanja, in njegovo kristalno strukturo v kompleksu s človeško BChE, smo uporabili kot osnovo za načrtovanje multifunkcionalnih ligandov predstavljenih v tem delu. Spojina 1 zavira spontano agregacijo amiloida beta do toksičnih oligomerov in fibrilov, zaradi česar deluje nevroprotektivno. Ob upoštevanju pomembne vloge kovinskih ionov v nastanku Alzheimerjeve bolezni, smo naftalen spojine 1 zamenjali z nitroksolinom, ki deluje kot kelator dvovaletnih kovinskih ionov. Spojina 8g z nanomolarno zaviralno aktivnostjo na človeški BChE (IC50 = 215 nM) selektivno kompleksira bakrove(II) ione in zavira spontano agregacijo amiloida beta, hkrati pa ima tudi šibek antioksidativni učinek. Kristalna struktura te spojine v kompleksu s človeško BChE je razkrila vezavo nitroksolina v acil vezavni žepek in s tem pokazala, da je ta del vezavnega mesta sposoben vezati tudi od naftalena večje fragmente. Derivate nitroksolina tako smatramo kot dobro izhodišče za nadaljnjo optimizacijo učinkovin za terapijo Alzheimerjeve bolezni z multiplim mehanizmom delovanja. Vzporedno z razvojem multifunkcionalnih ligandov je potekala tudi optimizacija zaviralne aktivnosti spojine zadetka 1 ter raziskovanje odnosa med strukturo in zaviralnim delovanjem analogov. Velika večina sprememb v strukturi zaviralca je poslabšala zaviralno aktivnost. Z nadomestitvijo metoksietilne verige spojine 1 z 2-(dimetilamino)etilno verigo pa smo uspeli izkoristiti še dodatno interakcijo s Trp82 človeške BChE, kar je povečalo moč zaviranja, ki se pri spojini 3 giblje v pikomolarnem območju. Spojina je ohranila način vezave v aktivno mesto BChE in šibek nevroprotektiven učinek. Glede na pomembno vlogo oksidativnega stresa in motenj v porazdelitvi kovinskih ionov, smo v molekulo najboljšega reverzibilnega zaviralca BChE s piperidinsko strukturo 3 uvajali različne fragmente s sposobnostjo kompleksacije kovinskih ionov in antioksidativnimi lastnostmi. Spojini 8 in 11 z IC50 vrednostima za človeško BChE 13,8 ± 0,6 oziroma 11,1 ± 0,6 nM, spadata med najboljše zaviralce iz te serije. Kristalna struktura kompleksa spojine 11 in človeške BChE je, podobno kot za nitroksolinski derivat, pokazala vezavo 8-hidroksikinolinskega fragmenta v acil vezavni žep encima. Spojina je v kokristalu vezana tudi na površini med dvema monomeroma encima, kjer vezavno mesto tvorita dva plitva žepa. Alternativna vezava po vsej verjetnosti nima vpliva na aktivnost encima, spojina pa bi lahko bila potencialno uporabna kot spodbujevalec kristalizacije človeške BChE. 8-hidroksikinolinska derivata 8 in 11 kažeta tudi dobre antioksidativne lastnosti in kompleksacijo bakrovih(II) ionov, ki po vezavi v kompleks niso več redoks aktivni. Kljub temu, da spojini ne zavirata procesa spontane agregacije amiloida beta, spojina 11 ščiti nevroblastomske SH-SY5Y celice pred toksičnostjo fibrilov amiloida beta. Poleg navedenega oba analoga znižata znotrajcelične koncentracije reaktivnih kisikovih zvrsti, s pasivno difuzijo prehajata membrane v Caco2 celičnem modelu ter nista substrata za prenašalne proteine (primer P-glikoprotein). Derivata 8 in 11 zaradi dobrega profila dodatnih aktivnosti v primerjavi z nitroksolinskimi analogi in spodbudnih rezultatov na celičnih testih predstavljata naslednjo generacijo izboljšanih multifunkcionalnih ligandov za terapijo Alzheimerjeve bolezni. Poleg že vseh naštetih faktorjev je pri Alzheimerjevi bolezni opazna tudi povečana aktivnost monoamin oksidaze v določenih predelih možganov. Povečana oksidativna deaminacija zniža koncentracijo živčnih prenašalcev, kar privede do motenj v vedenju. Pri metabolizmu nastane tudi več toksičnih produktov, ki še dodatno prispevajo k oksidativnemu stresu in nevrodegeneraciji, zato predstavlja monoamin oksidaza dobro tarčo, preko katere lahko vplivamo tudi na vzroke nastanka Alzheimerjeve bolezni. Zelo pogosto se zaviralna aktivnost na monoamin oksidazi združi z zaviranjem ene ali obeh holin esteraz. V tem primeru govorimo o t.i. dualnih zaviralcih, ki jih je v literaturi opisanih kar nekaj, in jih lahko razdelimo na tri razrede: derivati propargilamina, kumarini in derivati naravnih spojin. Najbolj raziskana je zagotovo prva skupina, kjer spojina ASS234 in ladostigil kažeta dobre rezultate v predkliničnih testiranjih, slednji pa tudi v kliničnih fazah testiranj. Preko uvedbe propargilne skupine na piperidinski dušik analoga spojine zadetka 1 smo pri spojini 6 dosegli dualno mikromolarno zaviranje dveh encimov, BChE (IC50 = 2,600 ± 0,348 μM) in monoamin oksidaze B (IC50 = 53,904 ± 4,781 μM). Zaviranje monoamin oksidaze B je ireverzibilno in časovno odvisno, kar sovpada z literaturno znanimi podatki o zaviralcih propargilaminskega tipa. Spojina 6 v testu prehajanja s sistemom vzporednih umetnih membran kaže velik potencial za prehajanje krvno možganske pregrade, za nevroblastomske celice ni citotoksična, sočasno pa jih ščiti tudi pred toksičnostjo amiloida beta. N-propargilpiperidinske dualne zaviralce BChE in monoamin oksidaze B lahko tako smatramo kot dobro izhodišče za nadaljnjo optimizacijo in razvoj multiplih ligandov za terapijo Alzheimerjeve bolezni.[D. Knez]20172022-06-16 09:46:40Doktorska disertacija137413UDK: 615.21:616.894(043.3)COBISS_ID: 289975040sl