In vitro preučevanje metabolizma ter endokrinih učinkov izbranih bisfenolov in novejših bromiranih zaviralcev gorenjaGramec, Darja (Avtor) Peterlin-Mašič, Lucija (Mentor) kemikalijezaviralci gorenjabisfenol Aanalogiendokrini sistemtoksičnostjetrametabolizemmetabolitibioaktivacijaglukuronidacijaMotilci endokrinega sistema so po definiciji Svetovne zdravstvene organizacije iz leta 2002 opredeljeni kot od zunaj vnesene kemične snovi oziroma mešanice snovi, ki preko sprememb v delovanju hormonov povzročajo neželene učinke na zdravje posameznega organizma ali njegovega potomstva oziroma (sub)populacije (1). Izpostavljenost motilcem endokrinega sistema je povezana s številnimi boleznimi današnjega časa, kot so metabolni sindrom, srčno žilne bolezni, neplodnost in rak. Prisotni so povsod okoli nas, merljivi vplivi na biološke procese v telesu pa so bili dokazani že pri izredno nizkih koncentracijah, katerim smo tudi dejansko izpostavljeni. Bisfenol A, eden izmed najbolj znanih motilcev endokrinega sistema, lahko povzroči merljive spremembe v določenih celičnih funkcijah že pri koncentracijah od 1 pM-1 nM (2). Kljub obsežnim raziskavam, ki so bile v zadnjih letih opravljene na področju motilcev endokrinega sistema pa ostajajo številna vprašanja še vedno odprta in tako predstavljajo izziv za v prihodnje. V raziskavah smo se osredotočili na dve skupini potencialnih motilcev endokrinega sistema: strukturne analoge bisfenola A (BPA) in sicer bisfenol AF (BPAF), bisfenol S (BPS) in bisfenol F (BPF), ki se uporabljajo kot nadomestki BPA pri izdelavi plastičnih mas ter termalnega papirja ter na novejša bromirana zaviralca gorenja 2-etilheksil-2,3,4,5-tetrabromobenzoat (TBB) ter bis(2-etilheksil)2,3,4,5-tetrabromoftalat (TBPH). Slednja se z namenom preprečevanja gorenja dodajata izdelkom za vsakdanjo rabo, kot so na primer oblazinjeno pohištvo in elektronika. Izbrane spojine so s toksikološkega vidika izjemno zanimive, saj se množično uporabljajo in posledično smo jim ljudje vsakodnevno izpostavljeni. Kljub široki uporabi omenjenih spojin pa ostaja njihov vpliv na zdravje v veliki meri še neraziskan. V okviru doktorske naloge smo z in vitro metodami podrobno ovrednotili vpliv izbranih spojin ter njihovih metabolitov na naslednje endokrine receptorje v telesu: estrogenske (ER), androgenske (AR), tiroidne (TR), glukokortikoidne (GR), pregnanski X receptor (PXR), farnezoidni X receptor (FXR) ter na jedrna receptorja, aktivirana s peroksisomskim proliferatorjem (PPARα in PPARγ), pri čemer smo poseben poudarek namenili vplivu metabolizma na endokrino aktivnost. Metabolizem ima namreč lahko velik vpliv na samo endokrino aktivnost spojin. Za konjugate (glukuronide, sulfate,..) v večini primerov velja, da so brez aktivnosti na endokrinih receptorjih, medtem ko imajo lahko oksidativni metaboliti znatno večjo aktivnost od izhodne spojine (npr. Ipso metabolit BPA ima 500 krat večjo estrogeno aktivnost od BPA). V prvem sklopu raziskav smo podrobno proučili metabolizem izbranih bisfenolov. V članku z naslovom Differences in the glucuronidation of bisphenols F and S between two homologous human UGT enzymes, 1A9 and 1A10 smo proučevali glukuronidacijo izbranih bisfenolov tako z mikrosomskimi frakcijami kot tudi s posameznimi encimi UGT. Pokazali smo, da glukuronidacija predstavlja najpomembnejšo pot metabolizma za izbrane bisfenole, izpostavili pa smo tudi pomen ekstrahepatičnih tkiv pri glukuronidaciji bisfenolov. Zanimivo odkritje pa je, da so kljub veliki strukturni sorodnosti med izbranimi bisfenoli, različni UGT encimi odgovorni za njihovo glukuronidacijo. Jetrni encim UGT1A9 je bil najpomembnejši za glukuronidacijo BPS, UGT2B15 za BPA, črevesna UGT1A10 izooblika za BPF in UGT2A1 za BPAF (3). Pridobljene kinetične parametre glukuronidacije analogov BPA z jetrnimi in črevesnimi mikrosomi smo v sodelovanju z raziskovalci Švicarskega inštituta za tehnologijo uporabili pri postavitvi farmakokinetičnega modela, s katerim smo želeli ovrednotiti farmakokinetiko BPA in njegovih analogov ter posledično primerjati smiselnost zamenjave BPA z ostalimi bisfenoli, ter rezultate predstavili v članku z naslovom Physiologically based pharmacokinetic (PBPK) modeling of the bisphenols BPA, BPS, BPF, and BPAF with new experimental metabolic parameters: Comparing the pharmacokinetic behavior of BPA with its substitutes. Zgrajen fiziološki farmakokinetični model je prvi, ki opisuje kinetiko strukturnih analogov BPA in tako predstavlja pomemben prispevek k znanosti na področju farmakokinetike bisfenolov. Z uporabo modela smo ugotovili, da zamenjava BPA s strukturnimi analogi ne pomeni nujno tudi manjšega tveganja za endokrino delovanje. Ob enaki izpostavljenosti vsem testiranim bisfenolom smo namreč z modelom napovedali, da BPS doseže najvišje koncentracije v plazmi (4). V nadaljevanju smo proučevali oksidativni metabolizem bisfenolov. Pri tem smo se osredotočili predvsem na BPS, ter rezultate predstavili v članku z naslovom Influence of metabolism on endocrine activities of bisphenol S. Poglavitno oksidativno pretvorbo pri BPS predstavlja orto hidroksilacija aromatskega obroča, katalizirana s citokromi CYP3A4, CYP2C19 in CYP2C9, medtem ko hidroksilacija na meta mestu in tvorba ipso metabolita potekata v veliko manjšem obsegu. V nasprotju z BPA, pri BPS nismo detektirali reaktivnih metabolitov, ki smo jih merili kot konjugate z glutationom (5). V drugem sklopu raziskav pa smo se osredotočili na endokrine učinke izbranih spojin ter njihovih metabolitov. Pri tem smo uporabili različne in vitro testne sisteme: test s poročevalskim genom na GH3.TRE-Luc celični liniji (tiroidna aktivnost), test s poročevalskim genom na MDA-kb2 celični liniji (androgena in glukokortikoidna aktivnost), YES/YAS test na kvasovkah Saccharomyces cerevisiae (estrogena in androgena aktivnost) ter po OECD protokolu validiran test s poročevalskim genom na Hela9903 celični liniji (estrogena aktivnost). V sodelovanju z raziskovalci iz Medicinske fakultete, Univerze v Perugii, smo preverili delovanje izbranih spojin in metabolitov še na PXR, FXR ter na PPARα in PPARγ. V izvirnem znanstvenem članku z naslovom Influence of metabolism on endocrine activities of bisphenol S, smo pokazali, da metabolizem v primeru BPS deluje kot zaščitni sistem, ki zmanjša endokrino delovanje BPS ter tudi pospeši njegovo izločanje iz telesa. BPS je namreč deloval šibko agonistično na ER (EC50 = 84 μM), orto hidroksiliran metabolit je izkazoval še šibkejše delovanje na ER (EC50 = 670 μM), BPS glukuronid pa je bil brez aktivnosti (5). V članku z naslovom Endocrine activities and adipogenic effects in murine preadipocytes of bisphenol AF and its main metabolite (poslan v objavo) smo določali endokrino aktivnost BPA, BPAF in BPAF glukuronida. BPAF je v večini primerov izkazal močnejše delovanje na testirane receptorje kot pa BPA. Estrogena aktivnost BPAF, določena z in vitro testom na Hela9903 celični liniji, je bila 10 krat višja od aktivnosti BPA (EC50[BPAF] = 0,15 μM; EC50[BPA] = 1,12 μM). Prav tako je BPAF deloval močnejše antagonistično na TR (IC50[BPAF] = 7,6 μM; IC50[BPA] = 88,2 μM) in AR (IC50[BPAF] = 2,9 μM; IC50[BPA] = 5,5 μM). BPAF glukuronid je bil v nasprotju z izhodno spojino neaktiven na ER, TR, AR, GR in FXR receptorjih. Ugotovili pa smo antagonistično aktivnost BPAF glukuronida na PXR in PPARγ receptorja v mikromolarnem območju in tako pokazali, da glukuronid ni neaktiven metabolit, kot se je predvidevalo do sedaj. Rezultate testiranj endokrine aktivnosti smo nadgradili s proučevanjem njihovega vpliva na lipidno akumulacijo, saj je bilo že v predhodnih raziskavah potrjeno, da lahko BPA vpliva na adipogenezo. Ugotovili smo, da lahko tako BPAF kot tudi BPAF glukuronid značilno povečata lipidno akumulacijo ter ekspresijo številnih adipogenih markerjev. Zbrani rezultati kažejo, da imajo lahko tudi glukuronidi biološko aktivnost, kar predstavlja pomembno odkritje, hkrati pa kaže na nujnost nadaljnih raziskav na tem področju. Za izbrana zaviralca gorenja in njuna metabolita smo z uporabo in vitro testov ugotovili aktivnosti na številnih endokrinih receptorjih. V izvirnem znanstvenem članku z nasklovom New brominated flame retardants and their metabolites as activators of the pregnane X receptor smo z uporabo poročevalskega sistema na HepG2 celični liniji ugotovili, da sta tako zaviralca gorenja (TBB in TBPH) kot tudi njuna metabolita 2,3,4,5-tetrabromobenzojska kislina (TBBA) in 2-etilheksiltetrabromobenzoatni ester (TBMEPH) agonista PXR, ki je znan induktor metabolnih encimov in receptorjev. Metabolit TBMEPH je deloval močneje agonistično na PXR kot pa izhodna spojina TBPH. Vse testirane spojine so povečale izražanje gena za citokrom CYP3A4. Le-to lahko vodi do številnih neželenih interakcij na nivoju metabolizma (6). V članku z naslovom Estrogenic and androgenic activities of TBBA and TBMEPH, metabolites of novel brominated flame retardants, and selected bisphenols, using the XenoScreen XL YES/YAS assay smo z uporabo in vitro testa na kvasovkah preverjali delovanje izbranih spojin na ER in AR. Metabolita izbranih zaviralcev gorenja (TBBA in TBMEPH) sta delovala antagonistično na ER in AR, medtem ko sta bili izhodni spojini brez aktivnosti na omenjenih receptorjih. S tem smo potrdili hipotezo, da lahko metabolizem celo poveča biološko aktivnost izbranih spojin (7). V nadaljevanju pa smo z uporabo testa s poročevalskim genom za izbrana zaviralca gorenja določili še aktivnosti na GR in TR, ter rezultate objavili v članku z naslovom Comparison of in vitro hormone activities of novel flame retardants TBB, TBPH and their metabolites TBBA and TBMEPH using reporter gene assays. Ugotovili smo, da izkazujeta izbrana zaviralca gorenja (TBB in TBPH), ter njuna metabolita (TBBA in TBMEPH) antagonistično aktivnost na TR, izhodni spojini pa dodatno delujeta kot antagonista GR. Glede na njihovo široko uporabo in vsesplošno prisotnost v okolju obstaja utemeljena skrb za zdravje, predvsem pri najbolj ogroženih skupinah, kot so nosečnice in dojenčki (8). Med izvajanjem raziskav v okviru doktorske naloge smo pridobili obsežne podatke o metabolizmu in endokrinih učinkih bisfenolov ter novejših bromiranih zaviralcev gorenja. Potrdili smo, da izbrane spojine delujejo na številne endokrine receptorje v telesu in s tem odprli vprašanje, ali je s stališča varnosti njihova uporaba sploh upravičena. Ugotovili smo, da imajo lahko tudi glukuronidi endokrino aktivnost ter druge biološke učinke, kot je na primer vpliv na adipogenezo. S tem smo ovrgli dolgotrajno prepričanje, da so glukuronidi le neaktivni metaboliti, kar bo treba upoštevati tudi pri oceni tveganja za izbrane spojine. Opravljene raziskave predstavljajo dobro izhodišče pri izdelavi ocene tveganja za izbrane spojine, hkrati pa pridobljeni rezultati koristijo tudi splošni populaciji. Osveščanje o škodljivem delovanju izbranih spojin na endokrini sistem lahko namreč na dolgi rok vodi k manjši uporabi izbranih spojin pri izdelavi plastike, kot smo videli že pri BPA, pri čemer pa bo treba za njih najti ustrezne, varnejše alternative.[D. Gramec Skledar]20182022-06-15 13:17:22Doktorska disertacija137380UDK: 612.43:620.266.1(043.3)COBISS_ID: 296871168sl