Strukturno-podprto načrtovanje, sinteza in vrednotenje novih zaviralcev biosinteze peptidoglikanaRožman, Kaja (Avtor) Gobec, Stanislav (Mentor) Sova, Matej (Komentor) bakterijske infekcijezdravljenjeprotibakterijske učinkovinecelična stenapeptidoglikanbiosintezaencimiencimi Murundekaprelin pirofosfat sintetazapenicilin vezoči protein 2aencimski inhibitorjimikobakterijemikolne kislinenačrtovanjesintezavrednotenjerešetanjedisertacijeZdravljenje bakterijskih okužb zaradi porasta števila odpornih bakterijskih sevov postaja vse večji klinični problem. Številni neuspeli poskusi razvoja protibakterijskih učinkovin so terjali svoj davek v farmacevtski industriji, kjer so z leti začeli postopoma ukinjati ali pa vsaj omejevati finančni vložek v ta namen, kar pa je le še poslabšalo stanje v zdravstvenih ustanovah. Velik delež razvoja protibakterijskih učinkovin se je tako prenesel v akademske in druge raziskovalne ustanove. Za eno najpomembnejših tarč pri razvoju protibakterijskih učinkovin velja bakterijska celična stena. Ta je nujna za preživetje bakterij, saj ščiti organizem pred okoljskimi dejavniki, ohranja značilno obliko celice, vzdržuje osmotski pritisk znotraj celice in opravlja vlogo polprepustne membrane. Celična stena bakterij je v večji meri zgrajena iz peptidoglikana, sestavljenega iz ponavljajočih se amino sladkornih enot, ki so med sabo prečno povezane s peptidnim mostom. Biosinteza peptidoglikana poteka tako znotraj kot zunaj celične membrane. V tem procesu so udeleženi številni encimi, ki so potencialne tarče za razvoj protibakterijskih učinkovin. Protibakterijske učinkovine, ki delujejo na biosintezo peptidoglikana, tako onemogočijo nastanek celične stene bakterije in njeno smrt. Njihova glavna prednost je selektivna toksičnost in specifičnost. Posebnost mikobakterijske celične stene je debela plast mikolil-arabinogalaktana v kompleksu s peptidoglikanom, ki je prepredena s prostimi lipidi in številnimi proteini. Kompleksnost take celične stene predstavlja največjo oviro in hkrati izziv v razvoju novih učinkovin za zdravljenje tuberkuloze. V doktorskem delu predstavljamo načrtovanje zaviralcev encimov Mur, UppS in PPB2a, ki sodelujejo pri biosintezi peptidoglikana bodisi v citoplazemskih ali končnih modifikacijskih stopnjah. Prav tako smo se posvetili razvoju zaviralcev encima InhA, vpletenega v sintezo mikolnih kislin, ki predstavljajo pomemben del celične stene mikobakterij. Osredotočili smo se na moderne metode načrtovanja učinkovin, kot sta strukturno podprto načrtovanje in rešetanje visoke zmogljivosti. Razvoj računalniških metod je v zadnjih letih doživel velik vzpon in je trenutno vodilni pristop odkrivanja novih spojin zadetkov na številnih terapevtskih tarčah. V okviru doktorskega dela smo uporabili različne starejše metode in validirali nekatere novejše računalinške programe, ki so jih Kaja Rožman: Strukturno-podprto načrtovanje, sinteza in vrednotenje novih zaviralcev biosinteze peptidoglikana razvili naši partnerji iz Kemijskega inštituta v Ljubljani. Pridobljene spojine zadetke smo v nadaljevanju biološko ovrednotili in uporabili kot izhodišče za nadaljnjo optimizacijo. Encimi Mur v citoplazmi bakterijske celice katalizirajo nastanek UDP-N-acetilmuramoil pentapeptida, prekurzorja peptidoglikanske verige. Z uporabo spletnega strežnika ProBiS-CHARMMing smo simulirali proces induciranega prileganja encima MurA iz Escherichia coli ob vezavi liganda TAV iz kristalne strukture encima MurA iz Enterobacter cloacae. Tako smo povzročili odprtje in povečanje aktivnega mesta encima, ki smo ga uspešno uporabili kot osnovo virtualnega rešetanja filtrirane knjižnice spojin `ZINC Drugs Now´. Pridobili smo tri spojine zadetke, in sicer derivate dikarboksilne kisline, kinazolinona ter pirolopiridina, ki so in vitro zavirali encim MurA iz E. coli v mikromolarnem območju (v istem zaporedju, IC50 = 1 μM, 82 μM in 109 μM). Sintetizirali smo večjo serijo derivatov kinazolinonskega tipa, pri čemer smo sistematično spreminjali posamezne fragmente kinazolinona in vpeljali različne substituente. Velika večina sprememb je povzročila znižanje jakosti delovanja zaviralcev. Z odstranitvijo metilenskega distančnika na mestu 2 med obema dušikoma kinazolinona ter sočasno vpeljavo 5-nitrofuranilne skupine na to mesto pa smo poleg zaviralnega delovanja na MurA pridobili še dobro protibakterijsko delovanje na seva E. coli in Staphylococcus aureus. Spojini 2-(5-nitro-furan-2-il)-3H-kinazolin-4-on (IC50 = 47 μM, MIC = 1-8 μg/mL) in njegov 3-izopropilni derivat (IC50 = 87 μM, MIC = 2-8 μg/mL) predstavljata dobro izhodišče za nadaljnjo optimizacijo zaviralcev MurA pri razvoju protibakterijskih učinkovin. Z rešetanjem knjižnice kinaznih zaviralcev podjetja GlaxoSmithKline na ligazah Mur smo prišli do 5 različnih strukturnih razredov zaviralcev. Vse zadetke smo najprej ponovno sintetizirali in tako potrdili njihovo strukturo. Z biokemijskimi testi smo potrdili zaviralno delovanje stilbenskega derivata MH-96 in mu določili mikromolarno območje delovanja na encimih MurC, MurD in MuF (IC50 = 39-104 μM) ter z metodo STD-NMR potrdili tudi vezavo na encim MurD. Domnevamo, da bi se ta spojina lahko vezala v ATP vezavno mesto in delovala kot ATP kompetitiven zaviralec, kar bomo v prihodnosti poskušali tudi dokazati. Spojina tako predstavlja obetavno izhodiščno točko za nadaljnjo optimizacijo in razvoj protibakterijskih učinkovin. Sintaza UppS sodeluje pri nastanku lipida II v citoplazmi bakterijske celice, tako da katalizira nastanek undekaprenil pirofosfata. Mehanizem delovanja in zaviranje samega encima je še precej neraziskano, kljub temu, da je za bakterijo esencialen encim. Na osnovi trenutno najbolj odmevnih bisfosfonatnih zaviralcev UppS, natančneje bisfosfonata BPH-629, smo zasnovali in silico farmakoforni model, ki nam je služil kot filter za presejanje več milijonske knjižnice spojin. Vzporedno s pripravo knjižnice pa smo upoštevajoč pomembnost dveh vezavnih mest, med katerim mesto 1 sovpada z vezavnim mestom substrata farnezil pirofosfata, protein oblikovali tako, da je postal primeren za sidranje spojin. Z biokemijskim vrednotenjem smo nato dokazali zaviralno delovanje trem derivatov benzojske kisline v mikromolarnem območju (IC50 = 24-45 μM). Spojine s kislinskim delom oponašajo pirofosfatni del substratov, zato predpostavljamo kompetitiven mehanizem zaviranja encima UppS. Kljub temu, da spojine nimajo protibakterijskega delovanja, pa predstavljajo dobro izhodišče za nadaljnjo optimizacijo spojin s ciljem izboljšanja prehajanja celične membrane bakterij. Transpeptidaza PBP2a je odgovorna za prečno premreženje peptidoglikanskih verig v zaključnih stopnjah sinteze celične stene bakterij. Specifično zaviranje PBP2a je v literaturi omenjeno kot ključno v razvoju ozkospektralnega antibiotika, saj je encim značilno izražen v na meticilin odpornem bakterijskem sevu (MRSA) kot mehanizem obrambe pred učinki penicilinov. Kot izhodišče iskanja novih zaviralcev smo vzeli kinazolinonski derivat, ki po kristalografskih podatkih za svoje zaviralno delovanje, podobno kot učinkovina ceftarolin, izkorišča vezavo v alosterično mesto PBP2a. Pripravili smo knjižnico spojin na osnovi podobnosti z omenjenim kinazolinonskim zaviralcem in spojine sidrali v alosterično mesto encima. Z biokemijskimi testi smo dokazali vezavo in zaviralno delovanje trem spojinam. Med temi je najboljši kinazolinski derivat Z729094432 zaviral encim pri koncentraciji 100 μM, hkrati pa deloval zaviralno na rast MRSA (MIC = 16 μg/mL), ne pa tudi na neodporni sev S. aureus (MIC > 128 μg/mL), kar priča o vzročni povezavi med zaviranjem encima in protibakterijskim delovanjem. Odkriti strukturno različni zaviralci PBP2a s protibakterijskim delovanjem po naši oceni predstavljajo izjemno obetajočo osnovo za nadaljnjo optimizacijo oziroma razvoj protibakterijskih učinkovin. Reduktaza enoil acil prenašalnega proteina InhA je pomembna tarča pri razvoju učinkovin za zdravljenje tuberkuloze. Nove zaviralce encima smo načrtovali po dveh poteh. V prvem primeru smo s programom LiSiCa na osnovi podobnosti z znanima nanomolarnima zaviralcema, tiadiazolom 8 in tetrahidropiranom 9, poiskali nove, strukturno različne spojine, v drugem primeru pa smo z vtičnikom ProBiS iskali ligande iz proteinske baze PDB, ki se vežejo v aktivna mesta encimov s podobno strukturo kot jo ima InhA. Najbolje ocenjenih 17 spojin na osnovi podobnosti in 8 ligandov iz baze PDB smo naročili ter biokemijsko ovrednotili. Najboljši spojini, ligandu 09T, smo določili mešani tip zaviranja z določeno Ki vrednostjo 4 ± 1 μM. Čeprav je spojina šibkejši zaviralec od izhodiščnih molekul, pa zaradi precej majhne molekulske mase lahko služi kot dober fragment za nadaljnjo optimizacijo.[K. Rožman]20182022-06-15 13:04:47Doktorska disertacija137377UDK: 615.281.9(043.3)COBISS_ID: 295287808sl