Pogostnost monoklonske B-celične limfocitoze pri zdravih osebah DolenjskeBajuk, Petra (Avtor) Podgornik, Helena (Mentor) Božič, Borut (Komentor) monoklonska B-celična limfocitozaincidencaDolenjskadisertacijeMonoklonska B-celična limfocitoza (MBL) je predstopnja kronične limfatične levkemije (KLL). Pogosteje se pojavlja pri starejših, moških in pri posameznikih, ki imajo v prvem kolenu sorodnika s KLL. Za določitev MBL mora biti v krvi preiskovanca manj kot 5 × 109 limfocitov B/L, pri čemer s pretočno citometrijo (PC) ugotovimo značilen imunofenotip, ki ga lahko spremljata abnormalno razmerje lahkih verig imunoglobulinov κ : λ in preureditev težkih verig IgVH, obenem pa izključimo KLL ali drugi B-celični limfom. Glede na imunofenotip ločimo KLL-značilno MBL, CD5– MBL in atipično MBL. KLL-značilna MBL ima podoben imunofenotip kot KLL in je najpogostejši podtip MBL. Glede na število monoklonskih limfocitov B jo ločimo še na presejalno MBL (sMBL) in klinično MBL (cMBL). CD5– MBL zaznamuje odsotnost izražanja CD5, atipično MBL pa visoko izražanje CD20. S preiskavo fluorescenčna »in situ« hibridizacija (FISH) lahko pri MBL odkrijemo nekatere citogenetske nepravilnosti, najpogostejši sta del(13)(q14) in trisomija 12. Pojavnost bolezni se v splošni populaciji giblje med 3 % in 5 %, vsako leto pa pri približno 2 % bolnikov bolezen napreduje v KLL. Bolezen se tudi do sedemkrat pogosteje pojavlja pri sorodnikih v prvem kolenu bolnikov s KLL. To je še posebno značilno za družine, kjer sta prisotna vsaj dva primera KLL. V Sloveniji podatkov o MBL še nimamo, zato smo se odločili narediti raziskavo o pojavnosti te bolezni in jo primerjati med zdravo splošno populacijo in sorodniki v prvem kolenu bolnikov s KLL. V doktorski disertaciji smo preverjali naslednje 3 hipoteze: 1. da je pojavnost MBL večja pri sorodnikih v prvem kolenu bolnikov s KLL kot tista v splošni populaciji, z uporabljenim načinom določanja je pojavnost bolezni moč odkriti med 5 % in 15 % preiskovane populacije; 2. da je najpogostejši podtip MBL pri sorodnikih bolnikov s KLL klinična oblika KLL-značilne MBL, pojavnost v obeh skupinah pa je večja pri moških; 3. prisotne so ponavljajoče citogenetske spremembe, najpogostejša je del(13q), status IgVH pa je pri večini vzorcev MBL mutiran. Za področje raziskave smo izbrali Dolenjsko, ki predstavlja tipično slovensko pokrajino. S pomočjo Splošne bolnišnice Novo mesto se je za sodelovanje v študiji iz te regije odločilo 54 sorodnikov v prvem kolenu bolnikov s KLL. Za vsakega od njih smo našli 3 zdrave preiskovance iz splošne populacije, ki so se s posameznim sorodnikom ujemali v spolu, starosti in kraju bivanja. Skupaj smo analizirali 216 vzorcev. Povprečna starost preiskovancev je bila 48,4 ± 13,1, mediana 48, starostni razpon pa od 23 do 88 let. Preiskovana moška populacija je bila mlajša (povprečna starost 46,5 ± 13,3, mediana 45,5, starostni razpon od 23 do 88 let) od ženske (povprečna starost 50 ± 12,9, mediana 49, starostni razpon od 25 do 86 let). Pri vseh vzorcih smo naredili popolno krvno sliko in tako izločili neznane hematološke bolezni. Vzorce smo najkasneje 12 ur po odvzemu krvi analizirali s 5-barvno pretočno citometrijo (κ, λ, CD5, CD19, CD20). Posamezno celično populacijo smo prepoznali kot klon MBL, če smo lahko zaznali vsaj 50 dogodkov z enakimi značilnostmi. Imunofenotip klona MBL smo določili po osamitvi populacije pozitivne na CD19. Izračunali smo tudi razmerje κ : λ. Pri vzorcih, kjer smo odkrili klon MBL, smo opravili standardno citogenetsko preiskavo in FISH. Analizo proganih kromosomov smo delali neposredno na gojenih vzorcih krvi. Iz vzorcev venske krvi MBL smo s pozitivno selekcijo izolirali CD19 pozitivne limfocite B. Na teh celicah smo izvedli analizo FISH, ki smo jo ponovili še na celicah po gojenju brez predhodne izolacije. Preverili smo prisotnost za KLL značilnih kromosomskih preureditev. Iz izoliranih celic smo pridobili DNA za določitev mutacijskega statusa IgVH. Med splošno populacijo smo klon MBL odkrili pri 7 od 162 preiskovancev (4,3 %), med vzorci sorodnikov v prvem kolenu bolnikov s KLL pa pri 3 od 54 preiskovancev (5,6 %). Skupaj smo MBL odkrili v desetih vzorcih oz. pri 4,6 % vseh preiskovancev. Pojavnost je bila pogostejša pri sorodnikih v prvem kolenu bolnikov s KLL, kar je bilo glede na ugotovitve objavljenih tujih študij tudi pričakovano. Povprečna starost preiskovane populacije je bila 48 let, zato bi bila lahko pojavnost MBL ob starejši kohorti še večja. Potrdili smo namreč predhodne ugotovitve tujih študij, da se s starostjo pojavnost bolezni povečuje. Pri 6 od 7 preiskovancev iz splošne populacije, ki so bili starejši od 40 let, smo odkrili MBL. Klon MBL smo pogosteje odkrili pri moških. Z imunofenotipizacijo nam je uspelo določiti vse podtipe MBL: 2 primera KLL-značilne MBL (1 primer cMBL in 1 primer sMBL), 2 primera CD5– MBL in 6 primerov atipične MBL. Za vzorec s klinično obliko KLL-značilne MBL je bilo v primerjavi z ostalimi vzorci značilno izrazito povečanje povprečnih vrednosti limfocitov B zaradi povečanega števila monoklonskih celic B. Z raziskavo smo pridobili prvi vpogled o pojavnosti te bolezni v naši državi. Povzamemo lahko, da je pojavnost MBL v Sloveniji s približno 5 % na podobni ravni kot v objavljenih evropskih študijah, še pogosteje pa se lahko pojavlja pri mlajših sorodnikih (≤ 50 let) v prvem kolenu bolnikov s KLL (okvirno 10 %). Razlike v podtipu MBL bi lahko pripisali izbiri kohorte, saj so tuje študije v povprečju preiskovale bistveno starejše populacije. Iz tega lahko sklepamo, da se predvsem pri mlajših odraslih lahko pogosteje pojavi bolezen z imunofenotipskimi značilnostmi atipične MBL. S preiskavo FISH smo odkrili kromosomske nepravilnosti. V vzorcu M82, ki ustreza cMBL, smo pri 91 % limfocitov B našli kromosomsko nepravilnost del(13q). V vzorcu F68 smo s preiskavo FISH zaznali kromosomsko nepravilnost trisomijo 12 le pri 5 % celic, ki smo jo potrdili tudi s standardno citogenetsko analizo proganih kromosomov (Tabela 16). S standardnimi citogenetskimi preiskavami smo določili tudi mitotski indeks (MI), ki je bil pri vzorcih MBL v povprečju višji (4,45 ‰) kot pri vzorcih zdravih preiskovancev (2,24 ‰). Pri dveh vzorcih s klonom MBL smo lahko določili mutacijski status IgVH. Pri vzorcu KLL-značilne MBL, podtip cMBL (M82), smo odkrili mutiran gen IGHV3-64 (94,1 % homologija). Drugi vzorec (M57c) z mutiranim genom IGHV3-15*02 (89,1 % homologija) pa je tudi predstavljal KLL-značilno MBL, in sicer podtip sMBL. Postavili smo presejalno metodo za analizo s 5-barvno pretočno citometrijo in določili njeno občutljivost s postavitvijo meje detekcije klona limfocitov MBL. Za potrditev klona MBL potrebujemo vsaj 50 dogodkov z istimi značilnostmi. Na desetih MBL vzorcih smo izvedli tudi citogenetske analize in prispevali nove podatke na tem področju, kar je do sedaj storila le malokatera študija. Naša preiskovana kohorta je bila mlajša v primerjavi z veliko večino tujih raziskav, zato bi lahko naša odkritja doprinesla k razumevanju pojavnosti in oblike te bolezni pri mlajših odraslih osebah. [P. Bajuk Franko]20182022-06-15 12:58:13Doktorska disertacija137375UDK: 616.155.3(497.434)(043.3)COBISS_ID: 294313728sl