Vpliv izbranih transkripcijskih dejavnikov iz družine SOX in c-MYB na uravnavanje izražanja gena RANKL v kostnih celicah pri osteoporoziKodrič, Klemen (Avtor) Marc, Janja (Mentor) osteoblastiosteoklastibeljakovinecitokiniRANKLgensko izražanjeuravnavanjepromotorjitranskripcijski dejavnikipatogenezaKostna remodelacija je skrbno uravnavan proces za ohranjanje homeostaze kalcija in fosfata v krvnem obtoku. Istočasno ta mehanizem skrbi tudi za strukturno integriteto kosti. Remodelacija poteka sklopljeno. Najprej osteoklasti kostnino razgradijo, nato jo osteoblasti znova izgradijo. Po fazi mirovanja se krog po nekaj letih ponovi. Da je sklopitev uravnotežena skrbijo mnogi lokalni in sistemski regulatorji, med katerimi so poglavitnega pomena PTH, vitamin D in triada proteinov RANKL/RANK/OPG. Protein RANKL je citokin, ki ga v kosteh sproščajo celice osteoblastne linije. RANKL deluje preko vezave na svoj receptor RANK, izražen na osteoklastih. RANKL aktivira ostaoklaste in kostno razgradnjo, ter deluje kot ena izmed sklopitvenih molekul med osteoblasti in osteoklasti. OPG je protein, ki delovanju proteina RANKL nasprotuje tako, da se veže nanj in s tem prepreči njegovo vezavo na RANK. Delovanje proteina RANKL in njegovo fiziološko vlogo ter vpletenost v kostna obolenja dobro poznamo, medtem ko je uravnavanje njegovega izražanja slabše preučeno. Poznamo nekaj transkripcijskih dejavnikov, ki na izražanje gena RANKL vplivajo preko distalnih regulatornih regij, npr. vitamin D, PTH in Runx2. Po drugi strani pa ostaja uravnavanje izražanja gena RANKL preko proksimalnega promotorja gena, ki je po navadi poglavitna regulatorna regija genov, v veliki meri nepoznano. Tako je bil namen te doktorske naloge preučiti proksimalni promotor gena RANKL in identificirati nove transkripcijske dejavnike, ki bi lahko vplivali na izražanje gena RANKL, ter bi lahko bili vpleteni v patogenezo najpogostejše kostne metabolne bolezni, osteoporoze. Osteoporoza je multifaktorska bolezen na katero vplivajo številni genetski in okoljski dejavniki. Mnogi avtorji so preiskovali z osteoporozo povezane polimorfizme, spremembe v izražanju genov ter spremembe v proteomu in metabolomu. Ugotovili so, da na bolezen vpliva veliko število pogostih sprememb v mnogih različnih genih. Danes še ne poznamo veliko takih sprememb, zato znamo pojasniti zgolj manjši del variance v mineralni kostni gostoti, ki predstavlja glavni kazalec bolezni. V prvem poglavju smo naredili pregled študij na vsegenomskem nivoju ter na osnovi rezultatov pripravili izhodišče za nadaljnje delo. V drugem poglavju smo opisali računalniško analizo proksimalnega promotorja gena s programom TF Search. Program je odkril potencialna vezavna mesta za različne transkripcijske dejavnike. Na podlagi podatkov iz literature smo se odločili, da se bomo osredotočili na transkripcijska dejavnika Sry in c-Myb. Preverili smo njun vpliv na aktivnost promotorja gena RANKL in odkrili, da c-Myb aktivira, Sry pa zavira aktivnost proksimalnega promotorja gena RANKL. Nadaljevali smo z čezmernim izražanjem in utišanjem genov c-Myb in Sry ter potrdili, da c-Myb poveča izražanje gena RANKL v celičnem modelu in vitro, medtem ko ga Sry zmanjša. Vpletenost teh transkripcijskih dejavnikov v uravnavanje izražanja RANKL in osteoporozo smo želeli potrditi tudi v pogojih in vivo, zato smo njuno izražanje in izražanje gena RANKL izmerili v vzorcih kosti preiskovancev z osteoporozo in brez bolezni. Odkrili smo, da je izražanje gena RANKL v kosteh osteoporotičnih moških povečano za 17-krat, v primerjavi s kontrolami. Prav tako smo odkrili, da je pri osteoporotičnih moških kostno izražanje za moške specifičnega gena Sry kar 105-krat manjše kot pri kontrolah. To nakazuje, da je pri moških z osteoporozo povečanje izražanja gena RANKL posledica zmanjšanega izražanja gena Sry, ter da so razlike med spoloma v izražanju gena RANKL in v kvaliteti kostnine posledica delovanja za moške specifičnega transkripcijskega dejavnika Sry. Kostno izražanje gena c-Myb je bilo pri osebah z osteoporozo zmanjšano, zato ga v patogenezo osteoporoze ne moremo vplesti. Smo pa potrdili njegovo vlogo v kostni biologiji. V tretjem poglavju smo preverjali, ali tudi drugi člani družine transkripcijskih dejavnikov SOX (poleg Sry) uravnavajo izražanje gena RANKL preko proksimalnega promotorja, ter ali so vpleteni v patogenezo osteoporoze. Z uporabo celičnih modelov in vitro smo preverili ali lahko SOX4, SOX5, SOX6 in SOX9 uravnavajo aktivnost promotorja gena RANKL, ter ali lahko uravnavajo njegovo izražanje. Z uporabo človeškega kostnega tkiva smo testirali relevantnost naših rezultatov in vivo. Dokazali smo, da SOX5 in SOX9 aktivirata promotor gena RANKL ter povečata njegovo izražanje v osteoblastnih celičnih modelih. Poleg tega smo pokazali, da je v kostnem tkivu moških z osteoporozo izražanje gena RANKL povečano, izražanje gena SOX9 pa zmanjšano, v primerjavi s kontrolami, ter da bi izražanje gena SOX9 lahko imelo napovedno vrednost za osteoporozo. Osteoporotična in kontrolna skupina preiskovancev sta bili potrjeni z uporabo slikovne tehnike mikro-CT, trenutno najboljše tehnike za analizo strukture in kvalitete kostnega tkiva. V dodatnem poglavju smo preverjali, ali transkripcijski dejavniki iz družine SOX vplivajo na izražanje gena RANKL in na kostne spremembe tudi pri osteoartrozi. Avtorji mnogih študij namreč opisujejo kostni fenotip pri tej bolezni kot nasproten tistemu pri osteoporozi, vendar rezultati niso enotni. Naši rezultati so pokazali razgrajeno strukturo subhondralne kostnine pri osteoartrozi in povečano izražanje genov RANKL in SOX5 ter zmanjšano izražanje gena SOX9, v primerjavi s kontrolnimi kostnimi vzorci. Nadalje smo odkrili, da mezenhimske matične celice, izolirane iz vzorcev kosti osteoartroznih bolnikov, izražajo več SOX5 in RANKL kakor mezenhimske matične celice kontrolnih bolnikov po osteogeni diferenciaciji. S tem smo potrdili, da bi transkripcijski dejavniki iz družine SOX lahko prispevali h kostnim spremembam, ki smo jih potrdili pri bolnikih z osteoartrozo, in sicer preko poveča izražanja gena RANKL. V doktorski nalogi smo odkrili nove transkricpijske dejavnike, ki na izražanje gena RANKL vplivajo preko vezave na proksimalni promotor gena, ter so vpleteni v kostne spremembe pri osteoporozi (c-Myb, Sry, SOX5 in SOX9) in tudi osteoartrozi (SOX5 in SOX9). Transkripcijski dejavniki gena RANKL predstavljajo nove tarče za napoved, diagnozo in zdravljenje kostnih bolezni. [K. Kodrič]20192022-06-10 11:09:17Doktorska disertacija137327UDK: 577.21:616.71-007.23(043.3)COBISS_ID: 302178816sl