Razvoj in implementacija analiznih metod za spremljanje sestave in razgradnih poti polisorbatov v medijih in formulacijah terapevtskih proteinovBrovč, Ema Valentina (Avtor) Pajk, Stane (Mentor) Mravljak, Janez (Komentor) polisorbatirazgradnjarazvoj formulacijinterakcije polisorbatovliofilizacija formulacijstabilnost polisorbatovTekom razvoja končnih biofarmacevtskih izdelkov je glavni izziv razviti varno, učinkovito in kakovostno zdravilo s čim daljšim rokom uporabe. Večina bioloških zdravil na tržišču je terapevtskih proteinov, ki so v primerjavi s klasičnimi zdravili manj stabilni. Proteini so podvrženi kompleksnim razgradnim potem predvsem zaradi njihove velikosti in raznolike strukture. Z namenom, da bi jih zaščitili pred stresom na medfaznih površinah, in z namenom preprečitve agregacije in denaturacije proteinov v vodnih raztopinah, v formulacije dodajamo površinsko aktivne snovi. Polisorbati so najpogosteje uporabljene površinsko aktivne snovi v farmacevtski industriji in so prisotni v več kot 80 % komercialno dostopnih formulacijah z monoklonskimi protitelesi. V okviru doktorskega dela smo celovito ovrednotili polisorbate kot stabilizatorje bioloških zdravil. Razvili in optimizirali smo analizno metodo tekočinske kromatografije ultra visoke ločljivosti sklopljene z masno spektrometrijo visoke ločljivosti, ki omogoča nadzor kakovosti vhodnih polisorbatov, identifikacijo posameznih zvrsti polisorbatov, primerjavo med različnimi kakovostmi in proizvajalci polisorbatov, identifikacijo nečistot v vzorcih polisorbatov in spremljanje nastanka njihovih razgradnih produktov. Proste maščobne kisline so pomemben pokazatelj kakovosti intaktnih polisorbatov, indikator njihove razgradnje in eden od glavnih razlogov za tvorbo delcev v formulacijah s proteini. Ker je trenutno edina farmakopejska metoda, ki zazna prisotnost prostih maščobnih kislin v polisorbatih, nespecifična metoda za določanje kislinskega števila, smo razvili hitro in enostavno metodo jedrske magnetne resonance za kvantitativno določitev prostih maščobnih kislin v polisorbatih. Preučili smo vpliv sestave formulacije na stabilnost polisorbatov, zato smo spremljali njihovo stabilnost v najpogosteje uporabljenih biofarmacevtskih pufrih in vrednotili vpliv proteinov ter ostalih pomožnih snovi na njihovo razgradnjo. Ker so polisorbati podvrženi hidrolizi in oksidaciji, smo pojasnili vzroke in mehanizme za razpad polisorbatov v histidinijevem kloridnem pufru. S pomočjo razgradnih produktov smo odkrili do sedaj še neznano razgradno pot polisorbatov: aminolizo. Preučili smo histidinske purfne sisteme z različnimi protiioni in identificirali protiione, ob katerih ne poteče s histidinom katalizirana hidroliza polisorbatov. Mehanizem razgradnje polisorbatov v histidinskem pufru smo potrdili tudi s pomočjo kvantno mehanskih izračunov. Preverili smo smiselnost dodajanja kelatorjev v formulacije s polisorbati in terapevtskimi proteini. Z askorbatnim testom in peptidnim kartiranjem smo dokazali, da nekateri kelatorji v kombinaciji s kovinskim ioni, kisikom in askorbatom oksidacijo proteinov celo dodatno pospešijo. Zato mora biti odločitev za dodatek kelatorjev podprta z ustreznimi eksperimentalnimi rezultati in ne del običajne prakse. Na osnovi podatkov o stabilnosti polisorbatov, njihovih razgradnih poteh in vplivu ostalih pomožnih snovi v formulaciji, bo načrtovanje formulacij s polisorbati veliko bolj racionalno. [E. V. Brovč]20212022-06-01 09:13:06Doktorska disertacija137075UDK: 543.544:615.32(043.3)COBISS_ID: 73154307sl