Izražanje in izolacija inhibitornega peptida za TACE, ki je zasnovan na osnovi zaporedja propeptidne regijePovšin, Jure (Avtor) Gaber, Aljaž (Mentor) TACEprodomenaizražanje in čiščenje proteinov.Disintegrinska metaloproteaza TACE oziroma ADAM17 je encim, ki spada v skupino šedaz ter specifično cepi prekurzorski faktor tumorske nekroze alfa. Poleg tega ima encim pomembno vlogo tudi pri procesiranju celičnih adhezijskih proteinov, citokinskih receptorjev ter ligandov EGF receptorjev, ki so potrebni za spodbujanje imunskega odziva in regeneracije. Zunajcelično večdomensko regijo TACE sestavljajo: prodomena, katalitična domena, disintegrinska domena, obmembranska domena ter regija CANDIS. Prodomena ima inhibitorno vlogo in je bila osrednja točka našega raziskovalnega dela. Priprava nativno zvite in stabilne prodomene je bila kar nekaj časa otežena, dokler niso znanstveniki naredili dvojnega mutanta prodomene (TPD-DM) z mutacijama R58A in C184A. V okviru raziskovalnega dela smo želeli pripraviti dovolj veliko količino take prodomene, da bi jo lahko uporabili za pripravo specifične kolone za čiščenje encima TACE z afinitetno kromatografijo. S tem bi olajšali in pospešili sam postopek čiščenja encima TACE. Uspelo nam je pripraviti genska zapisa za dva konstrukta TPD-DM, ki sta imela na N-koncu dodano heksahistidinsko oznako za lažje čiščenje proteina, eden od konstruktov pa je imel še regijo za cepitev s proteazo TEV, ki je omogočala odstranitev heksahistidinske oznake. Po uspešnem izražanju in čiščenju proteinov s kolono za IMAC ter dializi, so se nam proteini neželeno oborili, kar nam je onemogočilo izolacijo proteinov za vezavo na kolono. Poskušali smo optimizirati elucijo, z zmanjšanjem koncentracije imidazola v elucijskem pufru, in dializo, da bi ohranili enako koncentracijo soli, kot je bila v elucijskem pufru, vendar brez večjih uspehov. Ugotovili pa smo, da odcep heksahistidinske oznake najverjetneje poveča obarjanje proteina.20222022-04-20 10:40:00Diplomsko delo/naloga136217VisID: 18301COBISS_ID: 105482755sl