Vpliv motene presnove glukoze na kapilarno mrežo in na izražanje težkih verig miozina v skeletnih mišicah mišiUmek, Nejc (Avtor) Cvetko, Erika (Mentor) Eržen, Ida (Komentor) debelostzmanjšana občutljivost na inzulinskeletna mišicakapilarizacijatip mišičnih vlakenkopičenje znotrajceličnih lipidovUvod: Presnovne motnje, povezane z debelostjo, so eden glavnih vzrokov obolevnosti in umrljivosti v razvitem svetu. Strukturne in funkcionalne spremembe v skeletnih mišicah in kapilarni mreži so pomembno povezane z mehanizmi zmanjšane občutljivosti na inzulin zaradi debelosti. V poznih fazah debelosti je številska gostota počasnih, oksidativnih, na inzulin občutljivih mišičnih vlaken manjša zaradi pretvorbe v hitra, na inzulin manj občutljiva vlakna. Tudi kopičenje znotrajceličnih lipidnih kapljic v mišičnih vlaknih lahko prispeva k zmanjšanju odzivnosti na inzulin, ni pa še znano, kako sta kopičenje znotrajceličnih lipidnih kapljic in pretvorba med tipi mišičnih vlaken povezana. Pri napredovani debelosti z zmanjšano občutljivostjo na inzulin se gostota kapilarne mreže v skeletnih mišicah zmanjša, zmanjšata pa se tudi bazalni in z inzulinom spodbujen krvni pretok. V zgodnji fazi debelosti z zmanjšano občutljivostjo na inzulin so ugotovili povečano funkcionalno odzivnost žilja in kapilarne mreže na inzulin. Ali je takšen funkcionalni odziv žilja povezan tudi z morfološkimi spremembami v kapilarni mreži in ali pride do sprememb v številski gostoti različnih tipov mišičnih vlaken tudi v zgodnjih fazah debelosti, še ni pojasnjeno. Metode: Osemnajst 54 tednov starih miši (linije C57BL/6JOlaHsd) smo razdelili v dve poskusni skupini po devet miši: na debele miši, hranjene s krmo z višjo vsebnostjo maščob, in na vitke miši, hranjene s standardno krmo. Odzivnost na inzulin smo ocenili z oralnim tolerančnim testom za glukozo in meritvami koncentracije krvne glukoze na tešče. Značilnosti kapilarne mreže smo določali s 3D-analizo 100 µm debelih prečnih rezin mišice gluteus maximus. Z imunofluorescenčnimi tehnikami smo označili endotelij kapilar in bazalno membrano kapilar in mišičnih vlaken. Debele prečne rezine smo zajeli s konfokalnim mikroskopom in analizirali s pomočjo programske opreme Ellipse. Izražanje posameznih izooblik težkih verig miozina v zaporednih 10 µm debelih rezinah mišic gluteus maximus, gastrocnemius in plantaris smo ugotavljali s protitelesi proti izooblikam težkih verig miozina tipa 1, 2a, 2x/d in 2b. Primarna protitelesa smo prikazali s posredno imunoperoksidazno metodo. Vsebnost znotrajceličnih lipidov smo določali na 10 µm debelih rezinah mišic gastrocnemius, plantaris in soleus, obarvanih z barvilom Sudan Black B. Indeks vsebnosti lipidov smo izračunali kot stokrat pomnoženo razmerje med površino preseka mišičnega vlakna, ki so ga prekrivale lipidne kapljice, in površino celotnega preseka mišičnega vlakna. S primerjavo premerov mišičnih vlaken mišice gluteus maximus v 10 µm debelih nativnih tkivnih rezinah in v 100 µm debelih fiksiranih in imunofluorescenčno označenih tkivnih rezinah smo ugotavljali, ali se v debelih rezinah mišična vlakna deformirajo tudi v prečni ravnini. Rezultati: V primerjavi z vitkimi mišmi, hranjenimi s standardno krmo, so imele miši, hranjene s krmo z visoko vsebnostjo maščob, znatno večjo telesno maso (p = 0,0001) in bazalno glikemijo ter znižano toleranco za glukozo (p < 0,05). Gostota kapilarne mreže mišice gluteus maximus je bila pri debelih miših večja kot pri vitkih miših. Okoli majhnih mišičnih vlaken (< 40 µm) smo ugotovili značilno večjo dolžino kapilar na dolžino mišičnih vlaken in dolžino kapilar na površino mišičnih vlaken (p < 0,05), medtem ko se okoli velikih mišičnih vlaken gostota kapilarne mreže ni značilno spremenila. Vijugavost, anizotropija in premer mišičnih vlaken se med poskusnima skupinama niso značilno razlikovali. Pri počasni mišici soleus in hitri mišici gluteus maximus, ki ne nosita telesne teže, smo pri debelih miših ugotovili manjšo številsko gostoto počasnih tipov mišičnih vlaken kot pri vitkih miših (p < 0,05). Pri hitri mišici gastrocnemius in srednje hitri mišici plantaris, ki ne nosita telesne teže, v izražanju težkih verig miozina med poskusnima skupinama nismo ugotovili značilnih razlik. Pri debelih miših sta bila v primerjavi z vitkimi mišmi v hitrih in srednje hitrih mišicah gastrocnemius in plantaris premer mišičnih vlaken in vsebnost znotrajceličnih lipidov znatno večja v mišičnih vlaknih tipa 2a in 2x/d (p < 0,05). Ugotovili smo, da se vzorci debelih prečnih rezin skeletnih mišic med pripravo za konfokalno mikroskopijo v prečni ravnini raztegnejo (p < 0,001), v aksialni smeri pa skrčijo (p < 0,001). Pokazali smo pozitivno korelacijo med velikostjo raztezka v prečni ravnini in obsegom krčenja v aksialni smeri (r = 0,493, p < 0,01), pri čemer je bilo krčenje v aksialni smeri bolj izrazito pri prečno kot pri poševno odrezanih tkivnih rezinah. Zaključki: Pri debelih miših z zmanjšano občutljivostjo na inzulin se je kapilarna mreža okoli majhnih, bolj oksidativnih tipov mišičnih vlaken povečala, kar bi lahko bil zgodnji kompenzacijski mehanizem proti zmanjšanju odzivnosti na inzulin. Številska gostota hitrih tipov mišičnih vlaken se je povečala tako v počasnih kot tudi v hitrih mišicah, ki ne nosijo telesne teže. Nasprotno pa pri hitrih mišicah, ki nosijo telesno težo, nismo opazili značilnih sprememb v številski gostoti različnih tipov mišičnih vlaken. Iz tega sklepamo, da lahko povečana obremenitev mišic zaradi povečane telesne mase preprečuje nastanek sprememb v izražanju težkih verig miozina. Pri debelih miših je bilo kopičenje znotrajceličnih lipidov različno v različnih mišicah in v različnih tipih mišičnih vlaken; večje kopičenje smo opazili tako v hitrih kot počasnih mišicah, in sicer največje v mišičnih vlaknih tipa 1, 2a in 2x/d. Debele tkivne rezine se raztezajo v prečni ravnini in skrčijo v aksialni smeri, pri čemer je velikost raztezka v prečni ravnini delno odvisna od velikosti skrčenja v aksialni smeri. Deformacijo vzorca v aksialni smeri sicer lahko popravimo s kalibracijo, da pa bi dosegli, da bi bila tudi deformacija v prečni ravnini čim manjša, moramo optimizirati histološke protokole in tako maksimalno zmanjšati krčenje v aksialni ravnini.20212021-10-30 07:15:02Doktorsko delo/naloga132678VisID: 18678COBISS_ID: 83025155sl