Vpliv kokaprina in makrocipina na biofilm listerijZupan, Tanja (Avtor) Sabotič, Jerica (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) Listeria monocytogenesListeria innocuakokaprinmakrocipinbiofilmlisterijaPovzetek: Listeria monocytogenes je Gram pozitivna patogena bakterija, ki povzroča listeriozo. Pri delu smo uporabili njej sorodno nepatogeno vrsto Listeria innocua, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za L. monocytogenes. Bakterije rastejo v obliki biofilma, ki jim omogoča rast na različnih površinah in ima pomembno vlogo pri preživetju bakterij v okolju. Biofilmi listerije so običajno v literaturi opisani kot monoslojni, pri našem delu pa smo opazili, da tvori tudi dvosloj in večslojne strukture, podobne piramidam. Proteini iz gob predstavljajo razmeroma neraziskano skupino proteinov z edinstvenimi lastnostmi. Med njimi izstopajo inhibitorji peptidaz in lektini, med katerimi sta tudi kokaprin in makrocipin. Kokaprin (KKP1) je majhen neraziskan protein izoliran iz gobe Coprinopsis cinerea in deluje kot inhibitor cisteinskih in aspartatnih peptidaz ter lektin. Makrocipin (Mcp1) pa je inhibitor cisteinskih peptidaz iz gobe Macrolepiota procera. V bakterijskem ekspresijskem sistemu smo pripravili rekombinantne proteine Mcp1, KKP1 in štiri mutante KKP1 (KKP1-N22R, KKP1-D47R, KKP1-FH32EE, KKP1-G13E). Z merjenjem inhibitorne aktivnosti za encim papain smo potrdili inhibitorno aktivnost makrocipina, z encimoma papain in pepsin pa smo preverili inhibitorno aktivnost za KKP1 in njegove mutante. Med njimi je izstopal mutant KKP1-N22R, pri katerem smo uspešno spremenili reaktivno mesto za inhibicijo papaina. S tem smo nakazali, da ima kokaprin ločena mesta za inhibicijo cisteinskih in aspartatnih peptidaz. Z analizo nativne poliakrilamidne gelske elektroforeze smo pokazali, da se KKP1 in njegovi mutanti povezujejo v oligomere. Preverili smo vpliv izoliranih proteinov iz gob na biofilm bakterije L. innocua, za kar smo predhodno uspešno pripravili bakterije, ki so izražale različne reporterske proteine, od katerih se je najbolje izkazal DsRED Express. Poleg tega smo za detekcijo divjega tipa bakterij L. innocua preizkusili različne označevalce in barvila. Za najbolj uporabno se je izkazalo komercialno barvilo Mycolight Red, ki se veže na DNA bakterij. S preverjanjem, ali izbrani proteini iz gob vplivajo na razvoj biofilma bakterije L. innocua, smo ugotovili, da tako kokaprin kot makrocipin povzročita zmanjšano adhezijo bakterij na substrat. Opazili smo tudi viden učinek kokaprina na razbijanje statičnega biofilma in učinek makrocipina na razbijanje dinamičnega biofilma. Na adhezijo bakterij na substrat in na razbijanje zrelega statičnega biofilma imajo močnejši vpliv od KKP1 tri njegovi mutanti KKP1-N22R, KKP1-FH32EE in KKP1-G13E. Ti spremenjeni aminokislinski ostanki se nahajajo na isti strani KKP1, zato sklepamo, da se tam nahaja mesto, ki je pomembno za vezavo KKP1 na bakterije L. innocua. Tako kokaprin kot makrocipin torej vplivata na tvorbo biofilma bakterije L. innocua, zato bi bilo smiselno njun vpliv preveriti tudi na patogeno vrsto L. monocytogenes, ki predstavlja velik zdravstven problem. Če se vpliv izbranih proteinov iz gob na tvorbo biofilma patogene bakterije potrdi, bi jih lahko uporabili za nadaljnje študije in razvoj novih protimikrobnih snovi ali celo zdravil za zdravljenje okužb z listerijo.20212021-09-30 13:05:00Magistrsko delo/naloga131633VisID: 19021COBISS_ID: 87666691sl