Strukturna in funkcijska primerjava homologov širokospecifične fosfolipaze C iz bakterije Listeria monocytogenes ter karakterizacija njene prooblikeAdamek, Maksimiljan (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) fosfolipaza CListeria monocytogenesBacillus cereusClostridium perfringensprooblikaNekatere bakterijske fosfolipaze C so pomembni virulentni dejavniki v patogenezi bakterijskih okužb. Tako je v primeru Listeria monocytogenes, ki je znotrajcelična patogena bakterija in povzročiteljica potencialno smrtonosne bolezni listerioze. V tem magistrskem delu smo primerjali homologne širokospecifične fosfolipaze C iz bakterij Listeria monocytogenes (PC PLCLm), Bacillus cereus (PC PLCBc) in Clostridium perfringens (PC-PLCCp) ter proučevali proobliko listerijske fosfolipaze C (proPC-PLCLm). Vse proteine smo izolirali rekombinantno s heterolognim izražanjem v bakteriji Escherichia coli ter očistili s hitin afinitetno kromatografijo in gelsko izključitveno kromatografijo. S spektroskopijo cirkularnega dikroizma smo pokazali, da imajo vsi proteini v večini α-vijačno zvitje in so zelo termostabilni. S kolorimetrično metodo smo analizirali aktivnosti encimov do substratov v obliki multilamelarnih lipidnih veziklov (MLV). Pri enotnem, fiziološko relevantnem reakcijskem pogoju (MLV iz 100 % POPC, pH 6,5, 50 µM ZnSO4, 1 mM CaCl2) je za posamezni homolog fosfolipazna aktivnost padala v vrsti: PC-PLCBc, PC-PLCCp, PC PLCLm. Pri PC-PLCLm in PC PLCCp sta bili fosfolipazna in sfingomielinazna aktivnost medsebojno primerljivi, medtem ko je bila sfingomielinazna aktivnost PC PLCBc za 60 % nižja od fosfolipazne. ProPC PLCLm je po pričakovanjih kazala nizko fosfolipazno aktivnost. Lipidna sestava MLV (razmerje POPC, sfingomielina in holesterola) je pomembno vplivala na encimsko aktivnost. Testi kosedimentacije so pokazali, da sta vezavi prooblike in zrele oblike PC PLCLm na MLV primerljivi. ProPC PLCLm se je s časom odcepljal propeptid. Analiza proteolizne stabilnosti z dolgotrajno inkubacijo je pokazala, da inkubacija v pufru s pH 4,5 bistveno upočasni proteolizno cepitev proPC PLCLm. Dodatek EDTA in enojne zamenjave aminokislinskih ostankov aktivnega mesta PC PLCLm niso bistveno povečali stabilnosti prooblike. Ugotovitve iz tega magistrskega dela predstavljajo dobro izhodišče za nadaljnjo primerjavo homolognih PC PLC in proučevanje prooblike PC PLCLm.20212021-09-23 13:05:06Magistrsko delo/naloga131191VisID: 9961COBISS_ID: 85700099sl