Kloniranje biotin ligaze BioID2 in primerjava različnih biotin ligaz za namen iskanja interakcijskih partnerjevKomatar, Gašper Anton (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) TurboIDBioID2kloniranjemodel struktureinterakcijski partnerjiV razvoju je nova metoda iskanja interakcijskih partnerjev DNA, ki temelji na trikomponentnem sistemu, katerega osnova je označevanje bližnjih proteinov z biotinom. Trikomponentni sistem je sestavljen iz fuzijskega proteina z biotin ligazo, kontrolnega fuzijskega proteina in F-DNA, na kateri se nahaja fragment DNA, katerega interakcijski partnerji nas zanimajo, ki omogoča kolokalizacijo vseh omenjenih komponent. Biotin protein ligaze so sicer zelo specifični encimi, vendar jih z uvajanjem določenih mutacij preoblikujemo tako, da nespecifično označujejo proteine v njihovi bližini. Zato so zelo uporabne pri odkrivanju proteinskih interakcijskih partnerjev. Do zdaj so bile s trikomponentnim sistemom vse raziskave opravljene z biotin ligazo TurboID, a je bilo zaznati veliko nespecifične biotinilacije. Zanimalo nas je, če bi bilo z uporabo BioID2 slednje manj, kar bi izboljšalo razmerje signal/šum. Zato smo v našem eksperimentu nameravali najprej klonirati vektor z BioID2 v fuziji s proteinom Tus, ki se veže na F-DNA, izraziti rekombinantni fuzijski protein in primerjati delovanja tega encima z delovanjem encima TurboID v fuziji s Tus. Uspelo nam je pomnožiti posamezne fragmente z zapisi za omenjeni protein, jih sestaviti v vključek Tus-link72-BioID2 in ga ligirati z vektorjem pET-22b(+). Tako smo dobili vektor pET22b(+)_Tus-BioID2, ki se ga lahko uporabi za pripravo fuzijskega proteina v bakterijskem ekspresijskem sistemu. Po kloniranju smo delo nadaljevali z bioinformatsko analizo TurboID in BioID2. Najprej smo želeli dodatno razložiti mehanizem vzroka povečanja hitrosti biotinilacije TurboID in BioID2. Zato smo izvedli poravnavo modelov strukture BioID2 in TurboID z eksperimentalo določenimi strukturami biotin ligaz divjega tipa. Ugotovili smo, da se katalitična aktivnost BioID2 od divjega tipa razlikuje samo zaradi zamenjave aminokislinskega ostanka v aktivnem mestu in da samo z modeliranjem ne moremo pokazati razlik, ki bi nam pomagale bolje razumeti mehanizem delovanja TurboID. Za natančnejšo analizo bi morali določiti kristalno strukturo TurboID in jo primerjati s strukturo BirA. V zadnjem delu smo teoretično analizirali še aminokislinsko zgradbo BioID2 in TurboID ter začrtali nadaljnje korake, ki so potrebni, da bi potrdili ali ovrgli postavljeno hipotezo.20212021-09-17 15:20:01Diplomsko delo/naloga130821VisID: 16882COBISS_ID: 85632259sl