Izolacija in lastnosti rekombinantinh proteinov erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastorisPopošek, Larisa Lara (Avtor) Skočaj, Matej (Mentor) Grundner , Maja (Komentor) rekombinantni proteiniproteini z domeno MACPFerilizin Bpleurotolizin BizolacijakvasovkePichia pastorisProteina erilizin B (EryB) in pleurotolizin B (PlyB) sta 59 kDa velika proteina iz proteinske družine kompleksa, ki napade membrano/perforina (MACPF). Erilizin B je protein iz užitne gobe kraljevi ostrigar (Pleurotus eryngii), pleurotolizin B pa iz užitne gobe bukov ostrigar (P. ostreatus). V kombinaciji z egerolizinskim proteinskim partnerjem tvorita multimerne bikomponentne transmembranske pore v membranah, ki vsebujejo specifične lipidne receptorje, kar vodi v lizo tarčnih celic. Te proteine lahko rekombinantno izražamo v bakteriji Escherichia coli, vendar se proteina ne zvijata pravilno in se skoncentrirata v inkluzijskih telescih, zaradi česar je potrebna izolacija telesc in dodatno zvijanje proteina. Proteina EryB in PlyB smo zato želeli izražati v kvasovki Pichia pastoris ob uporabi konstitutivno izraženega promotorja GAP in z uporabo ekspresijskega vektorja pGAPZαA. Pričakovali smo, da se bosta proteina izražala v topni obliki in ju bomo na koncu lahko izolirali v višjih koncentracijah. Izražanje obeh proteinov smo preverjali z različnimi metodami. Spremljali smo hitrost rasti kvasovke P. pastoris in proteina skušali zaznati s poliakrilamidno gelsko elektroforezo ter s prenosom western, vendar proteinov nismo zaznali. Erilizin B in PlyB sta v kombinaciji z egerolizinskim partnerjem ostreolizinom A6 hemolitična, zato smo njuno prisotnost v gojišču preverili tudi s testom hemolize, vendar do lize eritrocitov ni prišlo. Na podlagi vseh rezultatov zato sklepamo, da kvasovka P. pastoris z ekspresijskim vektorjem pGAPZαA ni primeren ekspresijski sistem za pridobivanje rekombinantnih proteinov EryB in PlyB.[L. L. Popošek]20212021-09-12 07:16:53Magistrsko delo/naloga130257UDK: 577.112:582.28VisID: 196058COBISS_ID: 76657923sl